ИСТИНА

Определены каталитические характеристики разработанных гидролитических нанозимов in vivo, при их введении в организм в качестве антидотных (терапевтических) и защитных препаратов при различных способах введения. Установлено, что максимальная каталитическая эффективность наблюдается в случае использования ПЭГ-ПГК50 (блок-сополимер полиэтиленгликоля с полиглутаминовой кислотой) в соотношении фермент:полимер = 2:1. Исследована фармакокинетика функционирования нанозимных препаратов in vivo при различных способах их введения, а именно: внутримышечном, внутрибрюшном и перроральном/трансбуккальном. Высокая биодоступность и стабильность препаратов в крови позволили эффективно защищать организмы лабораторных животных против токсического действия ФОС, вводимого в двух смертельных дозах. При этом защитный эффект наблюдался, как минимум, в течение 2 ч при перроральном/трансбуккальном введении и не менее 6 ч при внутримышечном и внутрибрюшном. Установлены факторы защиты нанозимных препаратов, вводимых различными методами (внутрибрюшно и трансбуккально). Максимальный фактор защиты для внутрибрюшного введения нанозима составил 3,5±0,1; Проведена оптимизация формуляции нанозимных препаратов для обеспечения их эффективного каталитического действия при различных способах введения в организм. Показано, что целесообразной является добавка низкомолекулярного ПЭГ8, поскольку она приводит к улучшению проникновения нанозимов в кровь; Осуществлена оптимизация дозового режима введения нанозимов. Увеличение внутривенной дозы нанозима до 2500 Ед/кг позволило получить фактор защиты 5,8±0,2. На основании этих результатов можно рассчитывать на достижение фактора защиты 8÷9 при внутривенной дозе раствора нанозима с активностью 4200 Ед/кг. Показано, что местные инстилляции растворов СОД1 и СОД1-нанозима в глаза оказывают значительное влияние на клинические проявления иммуногенного увеита у кроликов, улучшают биохимические характеристики водянистой влаги и помогают поддерживать клетки различных тканей глаза в нормальном состоянии. Полученные результаты демонстрируют высокую потенциальную терапевтическую эффективность СОД1-нанозима для лечения воспалительных заболеваний глаз. Исследовано влияние одновременных инстилляций растворов СОД и каталазы на клинические проявления иммуногенного увеита у кроликов. Показано, что введение каталазы в формуляцию нанозима следует в настоящее время признать нецелесообразным. Показано, что внутривенное введение препаратов на основе супероксиддисмутазы крысам в остром периоде контузионной травмы спинного мозга у крыс безопасно по показателям выживаемости, частоты осложнений со стороны тазовых органов и прироста массы тела в течение 4 недель послеоперационного мониторинга. Найдено, что доза 5000 Ед/кг является оптимальной; дальнейшее повышение дозы (до 20000Ед/кг) отрицательно сказывается на результатах. Методом МРТ в динамике постоперационного периода были оценены объемы патологических полостей спинного мозга по сравнению с контрольными группами крыс (буфер, свободный СОД) и подтверждены данные относительно дозозависимого эффекта нано-СОД. По данным морфометрии нано-СОД на 20% уменьшали объем повреждения по сравнению с контрольной группой, и восстановление двигательных функций у таких животных проходило быстрее и эффективнее. Получены и охарактеризованы частицы двухслойной нано-СОД. Показана защитная функция полианиона при использовании глутарового альдегида (ГА) в качестве линкера. Применение линкера ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) более оправдано, если планируется использование больших доз препарата. Для получения максимального выхода по суммарной активности более перспективным является использование линкеров, реагирующих по аминогруппам (ГА). Полученные частицы обладают достаточно низкой цитотоксичностью, что позволяет рекомендовать их для экспериментов на животных. Разработаны основы теории универсального нетеплового способа управления биохимическими реакциями в суспензиях, содержащих ОМНЧ (однодоменные магнитные наночастицы) и пришитые к ним макромолекулы. Теория основана на наномеханических процессах, индуцируемых в реакционных ячейках вблизи магнитных наночастиц низкочастотным (не греющим) магнитным полем и сводящихся к деформации, изменению конформации прикрепленных к ним макромолекул, изменению их взаимного положения (или относительного положения отдельных активных групп), ускорению молекулярной диффузии. Реализация тех или иных механизмов в первую очередь зависит от параметров переменного магнитного поля (ПМП) и динамических деформационных свойств самих макромолекул (ММ), а также от динамических характеристик ОМНЧ и агрегатов, в состав которых они входят. Проанализированы механические особенности использования ОМНЧ в качестве преобразователей действия низкочастотного негреющего ПМП в деформацию прикреплённых к их поверхности ММ. Проведены численные оценки сил, напряжений и деформаций ММ, прикреплённых к ОМНЧ магнетита радиусом 7-10 нм, покрытых золотой оболочкой толщиной 5 нм. Разработана эскизная документация, выполнены рабочие чертежи, приобретены комплектующие, изготовлены нестандартные узлы, произведена сборка и отладка двух установок - Astra-M-SP и TOR 01/12 для экспериментального изучения влияния магнитных полей на активность ферментов разных классов, иммобилизованных на магнитных наночастицах. Произведена апробация экспериментальных установок. Проведен синтез магнитных наночастиц магнетита и наночастиц магнетита, покрытых золотом. Осуществлена функционализация поверхности наночастиц лигандами различной химической природы. Проведена характеризация полученных наночастиц: изучена морфология, определен их размер, концентрации и распределения частиц по размерам в коллоидном растворе. Проведена модификация наночастиц ферментами разных классов, которая подтверждена оценкой общего количества белка, оставшегося в системе, а также определением числа свободных аминогрупп в расчете на одну молекулу энзима. Получены агрегационно устойчивые нанокомплексы МНЧ-фермент с различными типами иммобилизации фермента - электростатической адсорбции и ковалентной иммобилизации. Изучено влияние действия ПМП на кинетику реакций, катализируемых иммобилизованными на МНЧ ферментами. Показано, что наблюдаемые эффекты зависят от типа иммобилизации белка на поверхности частиц и природы линкера. Для электростатически сорбированной СОД1 на магнитных наночастицах, модифицированных сополимером полилизин (ПЛЛ)-полиэтиленгликоль (ПЭГ), состава МНЧ-ПЛЛ100-ПЭГ происходит увеличение активности за счет обратимой десорбция фермента с поверхности частиц в результате релаксационного вращения МНЧ. Для ковалентно иммобилизованного химотрипсина на поверхности Fe3O4@Au наночастиц наблюдается эффект замедления реакции в случае жестких линкеров с малой длиной углеводородной цепи (L-цистеин, 3-меркаптопропионовая кислота, липоевая кислота) и не наблюдается в случае длинных и гибких линкеров (11-меркаптоундекановая кислота, меркаптополиэтиленгликолевая кислота). Синтезирован новый класс координационных соединений меди на основе 2-тиоксо-тетрагидро-4Н-имидазол-4-онов. Данные конфокальной микроскопии и исследование цитотоксичности синтезированных ингибиторов теломеразы по отношению к клеточным линиям карциномы печени человека, клеточной линии рака простаты человека и клеточной линии рака молочной железы показывают высокую перспективность данного класса соединений для дальнейших доклинических исследований. Разработан способ получения магнитных наночастиц (МНЧ) оксида железа, стабилизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА) и полиэтиленгликолем разного диаметра. Были получены МНЧ-БСА с диаметром 38,8±0,6 и 77,8±0,7 нм и индексом полидисперсности 0,172 ± 0,011 и 0,152 ± 0,003. Измерение Т2 релаксивности показало, что МНЧ-БСА большего размера обладают более высокими значениями Т2 релаксивности, чем МНЧ-БСА меньшего размера (271 ± 6 мМ-1с-1 и 161± 4 мМ-1с-1 соответственно). Показано, что высвобождение доксорубицина носит рН зависимый характер. В частности, спустя 24 часа при рН 7.4 происходит высвобождение только 20% лекарства, при рН 6,5 – 60%, а при рН 5.5 – 80%. Учитывая, что согласно литературным данным развитие опухолей сопровождается гипоксией и понижением значения рН, подобный эффект может привести к дополнительному высвобождению лекарства именно в опухолевой ткани. Получены стабильные липосомальные наноконтейнеры различного липидного состава, обладающие узким распределением по размерам (PdI = 0,17) и отрицательным ζ-потенциалом. Средний гидродинамический диаметр составил 178 нм. Емкость загрузки липосом, содержащих в составе мембраны анионный липид, цис-диамминдинитратплатиной (II) в 3 раза превысила емкость коммерчески доступного липосомального препарата Липоплатина. Цитотоксичность солей платины (цисплатина и цис-диамминдинитратплатины) понижалась при их инкапсулировании в липосомы вследствие медленного высвобождения лекарства из наноконтейнера. Показано, что механизм ускорения ферментативного лизиса E. coli под действием эндолизина Lys394 в присутствии PGLa и поли-L-аргинина с распределением молекулярных масс от 5 до 15 кДа заключается в образовании пор во внешней мембране E. сoli. Обнаружено, что под действием переменного магнитного поля в присутствии магнитных наночастиц, модифицированных дофамином, происходит ускорение лизиса клеточной стенки бактерий, катализируемое эндолизином Lys394. Показано что воздействие переменного магнитного поля на частицы, адсорбированные на поверхности бактериальных клеток приводит к образованию пор во внешнем липидном бислое клеточной стенки E .coli, достаточных для перехода β-лактамазы из периплазмы наружу в межклеточное пространство. Исследованы закономерности инактивации эндолизинов фагов phi 11 и phi 80α в условиях функционирования. Показано, что эндолизин фага phi 11 инактивируется в результате протеолиза, а эндолизин фага phi 80α – по мономолекулярному механизму. Установлено, что в условиях хранения эндолизин фага phi 11 стабилен (недели и месяцы), в то время как стабильность эндолизина фага phi 80α не является достаточной (часы и сутки). Обнаружено, что в процессе инактивации имеют место конформационные изменения, протеолиз, агрегация. Показана эффективность применения глицерина, трегалозы, глюкозы и сахарозы для стабилизации Lys394. На основании проведенного биоинформатического анализа геномов стафилококковых бактериофагов типа К отобраны белки, обладающие пептидогликан- или полисахарид-деградирующей активностью. Разработаны экспрессионные конструкции для получения рекомбинантных ферментов. Проведена экспрессия разработанных конструкций в клетках E. coli BL21(DE3) или AD494(DE3) и получены лабораторные образцы препаратов антистафилококковых ферментов.