ИСТИНА

Проведен дизайн и синтезированы хромогенные и флуорогенные пептидные субстраты, а также ингибиторы глутамин- и пролинспецифичных пептидаз. Структура синтезированных субстратов может быть выражена общей формулой A-Хаа-Yaa↓B, где А=Glp (пироглутамил), HBr, Z (бензилоксикарбонил); Xаа=Ala, Ala-Ala, Pro, Phe, Val, Yаа=Pro, Gln; B= pNA (п-нитроанилид), AMC (7-амидо-4-метилкумарин), βNA (β-нафтиламин); место предполагаемого гидролиза субстратов показано стрелкой. Присутствие в структуре субстратов п-нитроанилидной группы обеспечивает простоту и точность контроля ферментативной активности по измерению поглощения п-нитроанилина. Использование флуорогенных группировок позволяет повысить чувствительность измерений и разработать методы постэлектрофоретической детекции пептидаз в геле. Синтез субстратов (с выходами 75 -90%) осуществляли методом фрагментной конденсации под действием дициклогексилкарбодиимида. В качестве ингибиторов синтезированы производные пролина и изолейцина, содержащие на С-конце остатки циклических аминов – пиперидина (Pip), морфолина (Mf), имидазола (Im) - Pro-Pip, Pro-Mf, Pro-Im, Ile-Pip, Ile-Mf, Ile-Im. Для их получения была разработана эффективная 3-х стадийная схема синтеза, заключающаяся (1) в получении активированного N-оксисукцинимидного эфира защищенной аминокислоты; (2) ацилировании полученного производного соответствующим циклическим амином и (3) снятии N-концевой третбутилоксикарбонильной защитной группировки, использованной для временного блокирования NH-группы пролина, не участвующей в образовании пептидной связи (для обеспечения однозначного течения пептидного синтеза). Использование метода активированных эфиров позволило получить единственный продукт ацилирования, отличающийся хорошей способностью к кристаллизации и высокой активностью при аминолизе. Две карбонильные группы в гетероциклическом ядре N-гидроксисукцинимида значительно снижали электронную плотность на атоме углерода СО-группы аминокислоты, что значительно облегчало атаку нуклеофила (циклического амина). Разработанные подходы обеспечили получение целевых соединений в количествах, необходимых для дальнейших исследований их физико-химических характеристик и биологической активности. Чистота полученных соединений подтверждена данными аминокислотного анализа, MALDI-TOF масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии, ТСХ и ВЭЖХ. Флуоресцентные производные охарактеризованы также методом флуоресцентной спектроскопии. Биологическая активность полученных хромогенных и флуорогенных пептидов проверена на примере гидролиза их цистеиновыми пептидазами семейства С1 - растительными ферментами папаином, бромелаином, фицином, а также лизосомальными катепсинами В и L млекопитающих и человека и пролинспецифичными пептидазами насекомых вредителей зерновых запасов семейства тенебреонидов: дипептидилпептидазой IV, пролидазой, пролилкарбоксипептидазой и тканевой пролилолигопептидазой. Показано, что синтезированные соединения являются высокоспецифичными и селективными субстратами пролин- и глутаминспецифичных пептидаз различного происхождения. Ингибирующее действие Pro-Pip (Mf, Im) и Ile-Pip (Mf, Im) проверяли на сложном мультиферментном комплексе из пищеварительного комплекса личинок Tenebrio molitor и на коммерческом препарате α-химотрипсина быка. Показано, что синтезированные соединения совсем не ингибируют цистеиновые пептидазы, практически не влияют на химотрипсиновые и являются специфичными ингибиторами, как мы и предполагали, лишь для пролинрасщепляющих ферментов