| Результаты этапа: По результатам, полученным на данном этапе, были сделаны следующие выводы:
После повреждения роговицы при ее полной регенерации и патологическом ремоделировании реализуются две различные программы заполнения зоны повреждения стромальными клетками и клетками иммунной системы – при этом, исходя из наблюдаемой клональной экспансии мы можем заключить, что процесс заполнения зоны повреждения происходит как за счет миграции, так и за счет пролиферации большого количества стромальных клеток;
В отношении иннервации, являющейс необъодимым звеном восстановления ткани, при регенерации или ремоделировании роговицы также имеются признаки дифференциального ответа модели:
к 3 суткам происходит быстрое восстановление иннервации эпителия, однако в ходе дальнейшей регенерации эти нервные волокна утрачиваются к 7 суткам с восстановлением нормальной плотности нервных волокон;
при патологическом ремоделировании вплоть до 7 суток процесс восстановления иннервации не отличается от такового при регенерации, особенно к между 7 и 21 сутками после щелочного ожога происходит избыточное прорастание нервных волокон в строму роговицы, идущее одновременно с образованием бельма
отработан воспроизводимый протокол поэтапного забора пальцев передних конечностей у Mus musculus в ходе пренатального и раннего постнатального развития. Использование стереоскопического микроскопа и микрохирургической техники обеспечило высокую точность выделения целевых структур и сохранность морфологии развивающихся пальцев. Полученный материал соответствует требованиям к последующему транскриптомному анализу и позволяет сопоставить этапоспецифические изменения экспрессии генов в развивающейся дистальной части конечности.
выявлена тенденция к увеличению популяции PTHrP+ клеток в строме после индукции фиброза блеомицином, достигающая статистической значимости к 14-му дню эксперимента, т.е. в период перехода от острой воспалительной фазы к активному фиброгенезу с максимальным отложением коллагена. Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу о том, что часть PTHrP-позитивных клеток может вовлекаться в данный процесс посредством эпителиально-мезенхимного перехода с последующей миграцией из дыхательного эпителия в строму. Обнаружение этих клеток в строме указывает на их возможную роль в ремоделировании внеклеточного матрикса, однако, данные предположение требует дальнейших исследований и проверки.
На основании проведенных экспериментов разработана модель воспалительного повреждения сердца (по типу острого перикардита) у Acomys cahirinus, основанная на внутриперикардиальном введении комбинированного индуктора (адьюванта Фрейнда+зимозана А) и длительностью экспозиции 5 дней.
Acomys cahirinus демонстрируют более выраженные макроскопические проявления перикардита, а также активацию висцерального листка перикарда (утолщения эпикарда и увеличение числа Wt1+ активированных клеток), но имеют сниженный уровень воспалительной инфильтрации и сопоставимое число CD68+ макрофагов, в сравнении с M. Musculus. Исследование принципов взаимодействия воспаления и механизмов ответа на повреждение у Acomys spp. может иметь значение для выяснения эндогенной регенеративной программы, имеющей перспективы для разработки терапевтических стратегий, направленных на стимулирование регенерации и противодействия фиброзу.
Для выделения ядер из роговиц и дистальных фаланг пальца отработан эффективный протокол, позволяющий использовать их в дальнейшем для секвенирования РНК на платформе «10X Genomics». Сохраненная морфология ядер и низкий уровень агрегатов еще раз подтверждают высокое качество суспензии и эффективный лизис клеток для препаратов фаланги пальца, однако для роговицы глаза необходимо увеличение количества исходного материала для повышения конечной концентрации ядер с актуального значения в 4-6 тыс. до целевого в 10 тыс. ядер.
Для выбора оптимального метода выделения клеток из легких Mus musculus и Acomys cahirinus для дальнейшего РНК-секвенирования единичных клеток было отработано два протокола:
№1 – основанный на внутриполостной ферментативной обработке ткани, с последующим протиранием ее через металлическое сито,
№2 – основанный на предварительном механическом измельчении ткани с последующей ферментативной обработкой, который ранее не был протестирован на тканях Acomys cahirinus.
Нами показано, что при использовании второго протокола удаётся получить суспензию клеток, содержащую в 25 раз больше выделяемых клеток увеличивается более, а жизнеспособность клеток также возрастает более, чем в 1.5 раза, что является критичным для дальнейшей оценки параметров в популяции.
Было показано, что некоторые типы клеток вида Acomys cahirinus по морфологии и размеру практически не различимы при цитометрии свежевыделенных первичных культур, однако некоторые субпопуляции клеток, играющие ключевую роль как в развитии фиброза легких, так и в безрубцовом заживлении ткани у Acomys, не удалось типировать. Дальнейшее расширение палитры для получения релевантных результатов цитометрии предстоит проводить перебором и титрованием концентраций антител
повреждение тканей ногтя, предшествующее ампутации, частично стимулирует регенеративные процессы в дистальной фаланге пальца. Данный эффект выражен слабее при большем объеме ампутации, однако все же имеет место, что свидетельствует о чувствительности используемой нами животной модели к экзогенным воздействиям, направленным на стимуляцию регенерации. Это принципиальный момент для реализации дальнейших этапов проекта, направленных на поиск способов такой стимуляции при помощи генной терапии.
разработанный протокол позволяет обогащать внеклеточные везикулы культивируемых МСК целевыми микроРНК. Полученные везикулы могут служить эффективным переносчиком исследуемых микроРНК в таргетные клетки, разработанные экспериментальные подходы оформлены в виде Лабораторной методики.
реализована воспроизводимая модель инфаркта миокарда, позволяющая сопоставить особенности повреждения и репарации сердечной ткани у Acomys cahirinus и Mus musculus. Использование унифицированного протокола лигирования передней межжелудочковой ветви коронарной артерии обеспечивало сопоставимость степени ишемии между видами, что станет основой для изучения ранних молекулярных событий, определяющих различия в регенераторной способности миокарда.
Оба метода сборки кардиосфер – классический с использованием поли-D-лизина в качестве субстрата и альтернативный с использованием низкоадгезивного покрытия и U-образных лунок – имеют свои преимущества и недостатки. Преимущество классического подхода заключается в формировании кардиосфер, обладающих повышенной секреторной активностью и высоким проангиогенным потенциалом. Использование многолуночных планшетов с низкой адгезией и U-образным дном позволяет формировать кардиосферы более унифицировано и воспроизводимо, и обеспечивает васкуляризацию кардиосфер, что важно для тканевой инженерии. Этот метод выбран нами в качестве подхода к созданию платформы для прототипа препарата на основе генетически модифицированных клеток.
Пробоподготовка с использованием платформы SeekOne Digital Droplet System продемонстрировала высокую воспроизводимость и эффективность при работе с ядрами отдельных клеток, выделенных из миокарда мыши. Выбранная стратегия построения 5′-концевых транскриптомных библиотек обеспечила получение высококачественного материала, пригодного для дальнейшего секвенирования и анализа экспрессии на уровне единичных ядер. Полученные библиотеки отличались стабильными показателями концентрации и фрагментного состава, что подтверждает надежность применённого протокола и его пригодность для исследований в области клеточной гетерогенности, включая задачи, связанные с изучением молекулярных механизмов регенерации.
Генотипирование потомства трансгенных мышей линий Prrx1-cre/ERT2,-eGFP/Brainbow2.1 и PthRP-cre/ERT2/CAG-tdTomato показало стабильную передачу трансгенов через поколения. Мы можем наблюдать наличие трансгенов как у поколений год назад (№114-125 у PthRP мышей и №246-261 у Prrx1 мышей), так и у одних из последних на данный момент поколений (№308-319 у PthRP мышей и №674-689 у Prrx1 мышей). Неспецифических последовательностей не было обнаружено, что указывает на возможность их дальнейшего использования в исследованиях методами генетическогой трейсинга в моделях регенерации и фиброза.
Полученная нами культура МСК с пониженной экспрессией микроРНК-30а характеризуется также сниженным содержанием данной микроРНК в продуцируемых ей везикулах. Данная линия стромальных клеток в перспективе будет использована для выяснения механизмов развития и реверсии фиброза легких под воздействием компонентов, секретируемых МСК.
Модель высокожировой диеты способствовала развитию гипергликемии натощак у Mus musculus, в то время как Acomys cahirinus были защищены от развития метаболических нарушений при высокожировой диете. На следующих этапах работы планируется выяснить механизмы, через которые реализуется эта защита.
Анализ гистологических изображений продемонстрировал, что высокожировая диета стимулировала двукратное увеличение средней площади адипоцита у Mus musculus, что свидетельствует о гипертрофии адипоцитов, что коррелирует с процессами развития ожирения и сахарного диабета. У Acomys cahirinus наблюдалась аналогичная тенденция (р=0,0759), что не позволяет утверждать о развитии гипертрофии адипоцитов в случае иглистых мышей, хотя размер адипоцитов у Acomys cahirinus был достоверно больше по сравнению с Mus musculus
По итогам секвенирования 12 библиотек мы прикшли к выводу, что количество итоговых ридов превышает пороговые значения (от 10 до 20 тыс.), рекомендуемые для такого типа библиотек, в связи с чем ожидается, что данного объема данных будет достаточно для дальнейшего биоинформатического анализа, включая аннотацию клеточных типов и оценку дифференциальной экспрессии.
|
