ИСТИНА

Проект относится к сфере био-, нано- и каталитических технологий. В нем предусматривается разработка теоретических, методических и экспериментальных основ принципиально нового подхода к дистанционному управлению биохимическими реакциями с участием макромолекул (ММ), в частности, биологических катализаторов - ферментов, иммобилизованных на однодоменных магнитных наночастицах (МНЧ). Возможность с помощью переменного магнитного поля (ПМП) ультранизких частот (менее 3 кГц) приводить во вращательно-колебательное и поступательное движение МНЧ с прикрепленными к ним ММ позволяет осуществлять различные манипуляции на молекулярном уровне и воздействовать на структуру, каталитические свойства и функции этих ММ. Объектами исследования являются: а) динамика отдельных МНЧ сферической и иглообразной формы с органическими оболочками, а также их ансамблей и комплексов в ПМП различной частоты и напряженности; б) силы и деформации, создаваемые осциллирующими МНЧ в окружающих оболочках и ММ; в) величина и характер деформаций в прикрепленных к МНЧ макромолекулах, возникающие в них изменения межатомных расстояний (в частности, в активных центрах), вторичной/третичной структуры, спектра релаксационных процессов после экспозиции в ПМП; г) изменение активности ферментов/ингибиторов и кинетики биохимических реакций с их участием под действием ПМП варьируемых параметров; д) изменение под действием ПМП скорости выпуска меченых молекул (впоследствии - лекарственных веществ) из наноконтейнеров (мицелл, везикул, липосом) и клеток в присутствии МНЧ; е) изменение функций клеточных мембран и выживаемости клеток с прикрепленными к ним МНЧ под действием ПМП; ж) молекулярные механизмы процессов, происходящих под действием ПМП в перечисленных выше биообъектах, сопряженных с МНЧ. Актуальность проекта определяется тем, что существующие подходы к адресной доставке лекарств, их контролируемому выпуску, терапии онкологических заболеваний не удовлетворяют требованиям клинической практики. Низкая селективность и недостаточная пространственная локализация действия современных средств и методов, трудности дозирования и контролируемого выпуска лекарств, возникновение нежелательных побочных эффектов делают актуальным разработку принципиально новых стратегий их адресной доставки, контролируемого выпуска и управления активностью. Предлагаемый запатентованный и экспериментально апробированный подход позволяет устранить или радикально уменьшить недостатки существующих методов терапии опасных заболеваний.

The project relates to the field of bio-, nano - and catalytic technologies . During the project time we will develop theoretical, methodological and experimental bases of a new approach to remote control of the biochemical reactions involving macromolecules (MM), in particular, biological catalysts - enzymes immobilized on single-domain magnetic nanoparticles (MNP). Possibility of using an alternating magnetic field (AMF) with ultra-low frequencies (less than 3 kHz) driven in rotation-vibrational and translational motion of the MNP with attached MM allows various manipulations at the molecular level and affect the structure and function of the catalytic properties of these MM. The objects of study are: a) the dynamics of individual spherical and needle-shaped nanoparticles with organic shells, as well as their ensembles and complexes in AMF with different frequency and intensity; b) the strength and deformation caused by oscillating the AMF in the surrounding membranes and MM; c) the amount and nature strains in MNP attached to macromolecules, these changes arise in the interatomic distances (especially in the active centers) of the secondary / tertiary structure, spectrum after exposure of relaxation processes in the AMF; d) changes in the activity of enzymes/inhibitors, and the kinetics of the biochemical reactions involving them under AMF action with variable parameters; e) changes under the influence of AMF of the speed of release of labeled molecules (later - drugs) from nanocontainers (micelles, vesicles, liposomes ) and cells in the presence of MNP e) changing the functions of cell membranes and cell survival with attached MNP under the action of AMF; g) the molecular mechanisms of the processes occurring under the action of AMF in the above biological objects associated with the MNP. Relevance of the project is determined by the fact that existing approaches to targeted drug delivery, controlled release of them, cancer therapy does not meet the requirements of clinical practice. Low selectivity and lack of spatial localization of the operation of modern tools and methods, difficulties dosing and controlled release of drugs, the occurrence of undesirable side effects make the actual development of fundamentally new strategies for their targeted delivery, controlled release, and activity management. Proposed and experimentally tested patented concept allows to eliminate or drastically reduce the shortcomings of existing therapies for serious diseases.

Будут разработаны экспериментально верифицированные основы теории оптимизации структуры, морфологии, размеров и формы наноагрегатов/кластеров, содержащих магнитное ядро, защитную оболочку и функциональные молекулы, и способных изменять свои биохимические свойства под действием негреющего переменного магнитного поля (ПМП). Будут выявлены базовые закономерности влияния ПМП на структуру и биохимические свойства наноагрегатов, а также оптимизированы параметры ПМП. Это позволит целенаправленно создавать новые молекулярные биомедицинские технологии дистанционно контролируемого выпуска лекарственных средств из наноагрегатов, изменения их активности, индуцирования локального апоптоза малигнизированных клеток и других управляемых полем откликов как in vitro, так и in vivo.

Разработаны физико-математические модели комбинированного действия низкочастотного (НЧ) и высокочастотного (ВЧ) магнитного поля (МП) на биохимические объекты. Модели учитывают динамику перемагничивания, механического вращательно-колебательного движения, тепловыделения и распространения тепла от магнитных наночастиц (МНЧ) в окружающую среду. Проанализированы причины агрегации/дезагрегации функционализованных МНЧ в постоянном и НЧ МП поле. Даны оценки параметров системы и МП, необходимого для управления этими процессами. На примере химотрипсина (ХТ), «сшивающего» пару магнитных наночастиц, продемонстрирован эффект переменного магнитного поля (ПМП) на структуру и активность фермента. Применение НЧ МП в случае ассоциата МНЧ, образованного из ХТ и белкового ингибитора трипсина, позволяет разорвать прочную связь фермент – ингибитор. Изучено влияние ПМП на состояние мембраны липосом и экзосом с помощью включения в состав липидов флуоресцентной метки. Обнаружено, что экспозиция в ПМП приводит к значительному изменению сигнала поляризации флуоресценции метки, при этом наблюдается уменьшение вязкости. Методами ИК-спектроскопии показано, что под воздействием ПМП происходит дестабилизация липосомальной мембраны. Изучена интернализация магнитных липосом с доксорубицином на линии 4Т1 клеток рака молочной железы мышей. Определены параметры системы для достоверного проникновения доксорубицина в клетки. Исследовано влияние ПМП на эффективность лизиса грамотрицательных бактерий E. coli с использованием лизоцима куриного яйца и эндолизина Lys S394, субстратом которых является пептидогликан клеточной стенки. Под действием ПМП в присутствии функционализированных полиэтиленимином и дофамином МНЧ и ферментов лизис клеток существенно усиливается. По-видимому, происходит разупорядочивание внешней мембраны клеток E. coli, что способствует проникновению фермента к субстрату. На основе созданных моделей и проведенных экспериментов выработаны нормы и режимы действия ПМП для организмов.

Разработаны теоретические основы управления биохимическими системами негреющим низкочастотным магнитным полем (НЧ МП) посредством селективного и дозированного деформирования биоактивных молекул через специально сконструированные медиаторы – функционализированные магнитные наночастицы (МНЧ). Проанализирована динамика МНЧ с оболочками из золота и полимеров в НЧ МП, а также их агрегатов, содержащих 2 и более сшитые частицы. Определено соотношение моментов сил различной природы, действующих на МНЧ в НЧ МП, в функции от частоты и амплитуды поля. Для димерных комплексов, состоящих из двух МНЧ, сшитых полимерными линкерами и содержащими белковые макромолекулы, определены максимальные силы растяжения и напряжения сжатия, сдвига и кручения, которые могут возникнуть в макромолекулах белка, оказавшихся вблизи оси, соединяющей центры МНЧ. В НЧ МП с индукцией в несколько десятых тесла силы достигают амплитуды 100-1000 пН, а напряжения -0.1-1 ГПа. Т.е. реализуется «наношаровая мельница», способная генерировать высокие контактные напряжения и инактивировать макромолекулы ферментов или ингибиторов биохимических реакций. В соответствии с теоретически выработанными критериями оптимизации дизайна МНЧ, предназначенными для использования в качестве медиаторов для магнитомеханической стимуляции биомолекул, разработаны схемы и технологии их синтеза, а также методики их последующей функционализации. Разработаны методики синтеза и синтезированы МНЧ трех геометрических форм: сфероидные, «кубические» и стержнеобразные. Изменения условий синтеза позволяли проварьировать размеры изометрических частиц в диапазоне от 10 до 50 нм, а анизометрических – в пределах от 10 до 30 нм по меньшему размеру и от 60 до 120 нм - по большему. Поверхность МНЧ функционализировали органическими лигандами. с широким спектром органических молекул: дофамин, полиэтиленгликоль (ПЭГ), ПЭГ- силан, блоксополимер ПЛЛ – ПЭГ с различной длиной полилизина и др. Полученные МНЧ также покрывали золотой оболочкой толщиной 5-10 нм. В качестве лигандов здесь были также использованы L-цистеин, 3- меркаптопропионовая кислота, D,L-липоевая кислота, 11-меркаптоундекановая кислота, HS-ПЭГ (5kDa)-кислота, 2-меркаптоэтиламин. Такой дизайн и разработанные методики дали возможность получать различные кластеры из n = 2-3 МНЧ, которые были связаны ковалентными, электростатическими или более слабыми связями, и затем изучать действие НЧ МП на них в функции размеров, состава, количества отдельных компонентов и силы их взаимодействия. Описанный дизайн и разработанные технологии дали возможность исследовать роль различных по химическим, электрическим и механическим свойствам лигандов в процессах магнитомеханической регуляции биомолекул. Помимо роли природы лиганда в этих экспериментах была также установлена нетривиальная зависимость эффекта от напряженности НЧ МП. Активность химотрипсина повышалась с ростом Н до 110-120 кА/м, а при дальнейшем росте Н понижалась. В экспериментах с ферментом супероксиддисмутазы 1 (СОД1), иммобилизованном за счет электростатического взаимодействия с лигандами блоксополимера ПЛЛ-ПЭГ, наблюдался эффект НЧ МП другой природы. Активность фермента повышалась в результате действия поля. Было установлено, что эффект поля обусловлен высвобождением фермента из шубы, окружающей МНЧ, и переходом его в раствор. Таким образом, в работе теоретически и экспериментально показано, что НЧ МП (с частотой менее 1 кГц и индукцией до 1 Тл), действующее на специально сконструированные комплексы, содержащие одну или несколько МНЧ, может быть эффективным средством дистанционного управления биохимическими системами на молекулярном уровне локализации в отсутствие какого-либо нагрева. Разработаны теоретические модели поведения функционализованных магнитных частиц и их агрегатов (димеры, тримеры и т.д.) в однородном переменном магнитном поле. Разработанная модель продемонстрирована экспериментально на примере регуляции каталитической активности химотрипсина, «зажатого» между двумя МНЧ, под действием ПМП. Разработана модель кинетики вымывания лекарственных молекул из полимерной “шубы”, окружающей МНЧ, которое индуцируется вращательно-колебательным движением магнитной частицы в ПМП. Установлены зависимости кинетики вымывания от длины полимерных молекул шубы и энергии связи с ними лекарственных молекул. Разработанная модель подтверждена экспериментально на примере обратимой десорбции в раствор с поверхности модифицированных полимером МНЧ супероксиддисмутазы (СОД1) под действием ПМП. Проанализировано взаимодействие МНЧ с мембранами везикул, клеток. Оценены параметры ПМП, которые могут привести к деструкции мембраны и увеличению ее проницаемости для загруженных внутрь молекул лекарственного вещества. Теоретически установлено и экспериментально подтверждено, что стержнеобразные МНЧ действуют эффективнее, чем сферические, т.к. они могут индуцировать в мембране не только сдвиговые деформации, но и нормальные, пропорциональные аспектному отношению. Экспериментально изучены независимые оптические отклики системы – абсорбционные люминесцентные и поляризационные под действием ПМП. В 2016 году были достигнуты конкретные научные результаты, как в плане разработки теоретических моделей, так и в плане экспериментального исследования закономерностей влияния магнитных полей на различных объектах. Разработаны методы воздействия на биохимические системы, содержащие МНЧ, различными комбинациями магнитных полей, а также создана экспериментальная аппаратура. На гантелеобразных структурах магнетит-золото во вращающемся поле показано с помощью оптического микроскопа, что под действием вращающегося внешнего магнитного поля происходит контролируемая агрегация наночастиц. Была продолжена работа по созданию теоретических моделей влияния магнитных полей на биохимические системы в присутствии МНЧ. Разработаны подходы, учитывающие постоянное магнитное поле, исходя из предположения о возможности контролируемой агрегации маленьких магнитных наночастиц в более крупные ассоциаты, а также подходы, учитывающие, помимо магнито-механического воздействия низкочастотного магнитного поля, также и некоторый нагрев образца под действием высокочастотного МП. Теоретические подходы легли в основу заявки на изобретение. Была разработана концепция комбинированного воздействия магнитными полями, разработаны детали проекта и создана экспериментальная установка моноблочной конструкции для воздействия на биохимические системы различными комбинациями постоянных, низкочастотных (НЧ) негреющих и высокочастотных (ВЧ) греющих ПМП. На этапе 2016 года разработаны физико-математические модели (как аналитические, так и численные) комбинированного действия НЧ и ВЧ МП на различные объекты биохимических систем. Модели учитывают динамику перемагничивания, механического вращательно-колебательного движения, тепловыделения и распространения тепла от теплогенерирующих МНЧ в окружающую среду. Проанализированы причины и особенности агрегации/дезагрегации функционализованных МНЧ в постоянном и НЧ МП поле. Даны оценки параметров системы и МП, необходимого для управления этими процессами. На примере химотрипсина, «сшивающего» пару магнитных наночастиц, продемонстрирован эффект ПМП на структуру и активность фермента, зависящий от частоты поля и времени воздействия на систему (85% при пульсирующем режиме поля). Показано, что применение НЧ МП в случае ассоциата МНЧ, образованного из ХТ и белкового ингибитора трипсина, позволяет разорвать довольно прочную связь фермент – ингибитор. Были изучены закономерности действия ПМП на клеточные структуры. Разработана физическая модель, позволяющая оценить возможные эффекты магнитного поля на стержнеобразные частицы. Показано, что включение поля приводит МНЧ в сложное осциллирующее движение, напоминающее движение двухлопастного весла байдарки. Было показано, что совокупное действие нормальных и латеральных деформаций уже в полях с индукцией значительно меньше 1 Тл вызывает разрыхление мембраны и увеличение ее проницаемости задолго до разрушения. Экспериментально влияние магнитного поля на биологическую мембрану было изучено на примере липосом, экзосом, а также клеток E.coli. Было исследовано влияние переменного магнитного поля на состояние мембраны липосом и экзосом, а именно на микровязкость и плотность упаковки липидов с помощью включения в состав липидов флуоресцентной метки. Было обнаружено, что пятнадцати- и тридцати-минутная экспозиция в ПМП приводит к значительному изменению сигнала поляризации флуоресценции метки, причем для модельной липосомальной мембраны эффективное уменьшение вязкости происходит уже за 15 минут, чем для более жесткой экзосомальной мембраны. Большее время экспозиции приводит к большему эффекту. Описанная выше модель может быть полезна и для понимания эффектов очень маленьких (например, 5-10 нм) магнитных наночастиц, которые в определенных условиях, взаимодействуя друг с другом и с мембраной, могут собираться в двумерные «острова» или «палочки» и вести себя подобно описанным в теоретической модели стержнеобразным частицам, разупорядочивая мембрану везикул. Экспериментально, такие частицы были изучены в составе липосом. Методами ИК-спектроскопии было показано, что под действием ПМП действительно наблюдается дестабилизация липосомальной мембраны, но только после нескольких минут воздействия поля, что также было подтверждено методом просвечивающей электронной микроскопии. Изучена интернализация магнитных липосом с доксорубицином на линии 4Т1 клеток рака молочной железы мышей. Было показано, что предварительная обработка магнитных липосом ПМП с частотой 50 и 20 Гц и интенсивностью 145, 50 мТл в течение 15 мин позволяла выявить время инкубиирования липосом с клетками для достоверного проникновения доксорубицина в клетки. Обнаружено, что более длительное инкубирование образцов в течение 30 мин приводило к накоплению свободного доксорубицина в ядрах. Именно в этом случае была видна разница в интенсивности флуоресценции доксорубицина в образцах с липосомами без предварительной обработки полем и после обработки. В первом случае 30 мин недостаточно для того, чтобы доксорубицин вышел из липосом и накопился в ядрах. При предварительной обработке в ПМП из липосом высвобождается доксорубицин, который в дальнейшем аккумулируется в ядрах клеток. При исследовании действия ПМП на внешнюю мембрану клеточной стенки грамотрицательных бактерий E. coli в качестве «метки» были использованы ферменты, лизоцим куриного яйца и эндолизин Lys S394, использующие в качестве субстрата пептидогликан клеточной стенки, «закрытый» в грамотрицательных бактериях липидной мембраной. Было изучено влияние магнитного поля на эффективность лизиса клеток E. coli с использованием этих двух ферментов в присутствии функционализированных полимером, полиэтиленимином массой 25 кДа, и низкомолекулярным дофамином, магнитных стержнеобразных наночастиц. Было показано, что под действием ПМП лизис клеток в присутствии фермента и МНЧ существенно усиливается. Можно полагать, что, как и в случае липосом и экзосом, происходит разупорядочивание внешней мембраны клеток E. coli, что может способствовать более эффективному проникновению фермента к его субстрату, пептидогликану. В независимом эксперименте было изучено поведение флуоресцентной метки, нильского красного (Nile Red). Метка, встраиваясь в гидрофобную область мембраны, начинает флуоресцировать. Обнаружено, что под действием ПМП происходит существенное уменьшение флуоресценции метки. На основе разработанных моделей и проведенных экспериментов были выработаны обоснованные нормы и режимы действия ПМП для организмов. Проведен анализ и обобщение полученных теоретических и экспериментальных результатов, который подтвердил высокую эффективность и перспективность стратегии магнито-нано-механической актуации биомолекулярных систем.