Управление фиброзом тканей через регуляцию активации стромальных клеток-предшественников миофибробластовНИР

Management of tissue fibrosis through the regulation of myofibroblast stromal progenitors activation

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 15 мая 2023 г.-31 декабря 2023 г. Роль FAPа в активации и регуляции свойств стромальных клеток-предшественников миофибробластов
Результаты этапа: Наиболее частым исходом репаративной регенерации у млекопитающих является развитие фиброза, что в случаях обширного или хронического повреждения приводит к замещению функциональной ткани соединительной и является причиной серьезных заболеваний, обуславливающих почти 50% смертности в развитых странах. Поэтому важнейшей задачей биомедицины является изучение процессов развития фиброза с целью поиска эффективных способов его предотвращения и, возможно, полного или частичного разрешения с восстановлением функции поврежденных тканей. Основными эффекторными клетками фиброза считаются миофибробласты, которые формируют фибротические фокусы (fibrotic foci) – морфофункциональные единицы патологического фиброза, представляющие собой плотные отложения внеклеточного матрикса (ВКМ), в котором находятся синтетически активные миофибробласты. При этом пролиферативная и миграторная активность клеток выражена по периферии фокуса, образуя инвазивный фронт, обеспечивающий прогрессию фиброза, что во многом напоминает рост и инвазию злокачественных опухолей. Нерешенной актуальной задачей является выяснение механизмов появления активированных стромальных клеток на границе инвазивного фронта фибротического фокуса и дальнейшей их дифференцировки в миофибробласты. Известно, что активация различных клеточных типов, вносящих вклад в пул миофибробластов, сопровождается появлением экспрессии белка активации фибробластов альфа (FAPа). Этот же маркер описан для фибробластов, ассоциированных с опухолью (CAF), роль которых хорошо изучена в канцерогенезе, однако крайне мало известно о роли FAPа+ фибробластов в развитии фиброза. FAPа является мембранной протеазой, демонстрирующей экзо- и эндопептидазную активность, которая участвует в протеолизе ВКМ, облегчая инвазию клеток. С другой стороны, FAPа+ клетки способны к секреции ключевых белков профибротического ВКМ. Роль FAPа+ клеток в прогрессии фиброза на данный момент представляется весьма противоречивой. Ранее мы показали, что повреждение тканей легкого сопровождается появлением и накоплением FAPа+ клеток, что положительно коррелирует со степенью тяжести фиброза. Однако точный вклад FAPа+ клеток в ремоделирование фибротических фокусов и прогрессию или реверсию патологического фиброза остаётся неопределённым. В данном проекте впервые в фокусе внимания являются активированные стромальные клетки-предшественники миофиброластов (FAPа+ клетки) и получены новые данные о их роли в развитии прогрессирующего фиброза. На первом этапе проекта мы показали важную роль FAPа в процессах пролиферации, инвазии и дифференцировки стромальных клеток (легочных и дермальных фибробластов). В подобранных нами индукционных условиях культура активированных клеток соответствует свойствам, описанным в литературе для данной субпопуляции: экспрессирует FAPа и аSMA, не встроенный в стресс-фибриллы, и обладает высокой пролиферативной, инвазивной и сократительной активностью. Полученные результаты будут использованы для изучения свойств активированных клеток, в том числе FAPа+ активированных клеток, и их взаимодействия с другими типами клеток в дальнейшей работе. Получены генетически модифицированные линии фибробластов с отредактированным геном FAPа, с помощью которых будет установлено значение FAPа в модулировании функциональной активности стромальных клеток. Для оценки вклада ферментативной активности FAPа в функции активированных стромальных клеток нами также была успешно отработана методика обогащения биологических образцов белком FAPa с использованием иммунопреципитации и оценки специфической эндопептидазной активности FAPa методом зимографии. С использованием этих подходов мы подтвердили, что в лёгких мышей с блеомицин-индуцированным фиброзом существенно возрастает содержание белка FAPa. Учитывая имеющиеся в литературе сведения о представленности в разных тканях сплайс-форм FAPa, на первом этапе проекта мы изучили содержание известных сплайс-форм этого белка в экспериментальных образцах линий стромальных клеток из разных источников и тканей человека. Большинство исследуемых нами стромальных клеток, полученных из дермы, легких, жировой ткани из разных источников, эндометрия, а также от разных доноров, несмотря на вариабельность, показали, в целом, примерно схожую экспрессию фрагментов последовательности гена FAPa, кодирующих разные функциональные участки, что указывает на низкую вероятность альтернативного сплайсинга в этих линиях. Кроме того, нами получены данные об тканеспецифичности экспрессии FAPa в фибротизированной ткани легких, а также других органов (печень, почка, миокард, семенники, жировая ткань, артерия) у пациентов после пневмонии, вызванной вирусом SARS-COV-2. Показано, что при развитии короновирусной инфекции FAPа+ клетки могут вносить активный вклад в формирование соединительной ткани как минимум на ранней стадии развитии фиброза при фиброзе легких (Grade 1, 2 по R.Hubner, 2008) и почки. При этом вклад в формирование общего пула FAPа+ клеток лёгких, по-видимому, также могут вносить приходящие из кровеносного русла FAPа+ клетки костномозгового происхождения, инфильтрирующие в ткань. Важной задачей первого этапа проекта было проследить динамику развития морфофункциональных единиц фиброза тканей - фибротического фокуса - в животной модели фиброза легких in vivo у мышей и установить роль FAPа+ клеток в формировании, росте и ремоделировании фокуса. По результатам проведенных исследований мы предполагаем следующую динамику развития фиброза в легких: FAPa+ клетки формируются уже на ранних стадиях повреждения ткани за счёт сигналов, полученных от поврежденного эпителия, и начинают дифференцироваться в aSMA+ CD90+ миофибробласты. В дальнейшем это приводит к утолщению стенок альвеол как за счет пролиферативной активности FAPa+ клеток, так и за счёт их дифференцировки в миофибробласты и формированию фибротических фокусов, богатых фибронектином и, вероятно, другими белками ВКМ. В сформированном фибротическом фокусе aSMA+CD90- FAPa- негативные клетки формируют ядро фокуса, в то время как CD90+ FAPa+, CD90-FAPa и CD90+ FAPa- клетки формируют его периферию. Таким образом, получены первые данные о роли FAPа+ клеток в формировании и прогрессии фиброза, что в дальнейшем позволит сформулировать концепцию участия этих клеток в патогенезе фибропролиферативных заболеваний по аналогии с существующей научной парадигмой, объясняющей роль FAPа+ CAF в инвазии злокачественных опухолей. Результаты проекта позволят расширить и углубить представление о механизмах репаративной регенерации в постнатальных тканях млекопитающих. Полученные данные о молекулярно-клеточных механизмах прогрессирующего фиброза могут стать основой для разработки новых подходов к лечению фиброзирующих заболеваний, в том числе фиброза легких.
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Механизмы участия FAPa-экспрессирующих стромальных клеток в процессах, важных для патогенеза фиброза
Результаты этапа: Все задачи второго этапа работ были выполнены полностью. Основные результаты НИР: Наиболее частым исходом репаративной регенерации у млекопитающих является развитие фиброза, что в случаях обширного или хронического повреждения приводит к замещению функциональной ткани соединительной и является причиной серьезных заболеваний, обуславливающих почти 50% смертности в развитых странах. Поэтому важнейшей задачей биомедицины является изучение процессов развития фиброза с целью поиска эффективных способов его предотвращения и, возможно, полного или частичного разрешения с восстановлением функции поврежденных тканей. Основными эффекторными клетками фиброза считаются миофибробласты, которые формируют фибротические фокусы (fibrotic foci) – морфофункциональные единицы патологического фиброза, представляющие собой плотные отложения внеклеточного матрикса (ВКМ), в котором находятся синтетически активные миофибробласты. При этом пролиферативная и миграторная активность клеток выражена по периферии фокуса, образуя инвазивный фронт, обеспечивающий прогрессию фиброза, что во многом напоминает рост и инвазию злокачественных опухолей. Нерешенной актуальной задачей является выяснение механизмов появления активированных стромальных клеток на границе инвазивного фронта фибротического фокуса и дальнейшей их дифференцировки в миофибробласты. Известно, что активация различных клеточных типов, вносящих вклад в пул миофибробластов, сопровождается появлением экспрессии белка активации фибробластов альфа (FAPа). Этот же маркер описан для фибробластов, ассоциированных с опухолью (CAF), роль которых хорошо изучена в канцерогенезе, однако крайне мало известно о роли FAPа+ стромальных клеток в развитии фиброза. В данном проекте впервые в фокусе внимания являются активированные стромальные клетки-предшественники миофиброластов (FAPа+ клетки) и получены новые данные об их роли в развитии прогрессирующего фиброза. На втором этапе проекта мы исследовали клеточно-молекулярные механизмы дифференцировки этих клеток в миофибробласты, взаимодействия с белками ВКМ и клетками иммунной системы, влияния на ангиогенез, а также гетерогенность популяции FAPa+ клеток при фиброзе. С помощью иммунопреципитации и протеомного анализа мы установили несколько вероятных белков-партнеров FAPa и проследили динамику экспрессии некоторых из них в фибробластах, дифференцирующихся под воздействием TGFb. Применение специфического химического ингибитора FAPа позволило уточнить роль ферментативной активности FAPа в регуляции фенотипа и функций стромальных клеток. С использованием полученных нами генетически модифицированных линий фибробластов человека с подавлением или гиперэкспрессией FAPа была подробно изучена возможная роль этого белка в активации стромальных клеток и их дифференцировке в миофибробласты. Используя различные клеточные модели, мы подтвердили критическую роль FAPa в активации стромальных клеток, проявляющейся в повышении пролиферативной, миграторной и инвазивной активности. Можно предполагать активное участие FAPа-позитивных стромальных клеток в ремоделировании матриксного ядра фибротического фокуса. FAPa необходим для полноценной дифференцировки фибробластов в миофибробласты, но выраженность этого эффекта может быть донор-специфичным. Мы также сделали вывод о наличии тканеспецифичных различий влияния FAPа на функциональные свойства стромальных клеток. Были получены новые данные о взаимодействии FAPа+ стромальных клеток с иммунными клетками моноцитарно/макрофагального ряда. Макрофаги, поляризованные в М1- и М2а-направлениях, способствуют активации стромальных клеток, но не дифференцировке в миофибробласты. Паракринные сигналы от активированных стромальных клеток стимулируют экспрессию генов М2-макрофагов, а также снижают экспрессию некоторых генов М1-макрофагов, однако без значимой связи с уровнем FAPa. Нами установлен вклад FAPа в формирование и стабилизацию новообразованных капилляров на модели формирования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на клеточных пластах из стромальных клеток с модулируемой экспрессией FAPa. Важной задачей проекта было проследить динамику развития морфофункциональных единиц фиброза тканей - фибротического фокуса - в животной модели фиброза легких in vivo у мышей и установить роль FAPа+ клеток в формировании, росте и ремоделировании фокуса. Мы показали, что FAPa+ клетки появляются уже на ранних стадиях повреждения ткани и начинают дифференцироваться в aSMA+ миофибробласты. Это приводит к утолщению стенок альвеол как за счет пролиферативной активности FAPa+ клеток, так и за счёт их дифференцировки в миофибробласты и формированию фибротических фокусов. На сроках разрешения фиброза примерно к 4 месяцу наблюдается формирование новых структур, представляющих собой образования с высокой представленностью CD90+ клеток, которые мы назвали “фокусы ремоделирования”, а также много CD90+FAPa+ клеток. Поскольку такие зоны в основном окружают сохранившиеся aSMA+ участки, можно предположить, что именно эти клетки вносят существенный вклад в ремоделирование соединительной ткани. Таким образом, мы доказали, что FAPа+ клетки вносят существенный вклад как в инициацию фиброза, формирование фибротических фокусов, так и в ремоделирование фибротической ткани. Нами были выделены и проанализированы субпопуляции FAPa+ стромальных клеток (FAPa+CD90+ и FAPa+CD90-) из легких мышей с фиброзом легких, однако согласно данным гистологического анализа дизайн этой экспериментальной задачи будет оптимизирован на заключительном этапе проекта. Кроме того, с помощью биоинформатического анализа и дальнейшей валидации методом иммуноблотинга мы установили несколько микроРНК, потенциально связывающихся с мишенью мРНК FAPa и способные регулировать его экспрессию. Таким образом, нами получены оригинальные данные о роли FAPа+ клеток в формировании и прогрессии фиброза, что в дальнейшем позволит сформулировать концепцию участия этих клеток в патогенезе фибропролиферативных заболеваний. Результаты проекта позволят расширить и углубить представление о механизмах репаративной регенерации в постнатальных тканях млекопитающих и стать основой для разработки новых подходов к лечению фиброзирующих заболеваний, в том числе фиброза легких.
3 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Исследование подходов, позволяющих регулировать количество FAPа-положительных клеток и/или экспрессию FAPа в клетках-предшественниках миофибробластов
Результаты этапа: Наиболее частым исходом репаративной регенерации у млекопитающих является развитие фиброза, что в случаях обширного или хронического повреждения приводит к замещению функциональной ткани соединительной и является причиной серьезных заболеваний, обуславливающих почти 50% смертности в развитых странах. Поэтому важнейшей задачей биомедицины является изучение процессов развития фиброза с целью поиска эффективных способов его предотвращения и, возможно, полного или частичного разрешения с восстановлением функции поврежденных тканей. Основными эффекторными клетками фиброза считаются миофибробласты, которые формируют фибротические фокусы (fibrotic foci) – морфофункциональные единицы патологического фиброза, представляющие собой плотные отложения внеклеточного матрикса (ВКМ), в котором находятся синтетически активные миофибробласты. При этом пролиферативная и миграторная активность клеток выражена по периферии фокуса, образуя инвазивный фронт, обеспечивающий прогрессию фиброза, что во многом напоминает рост и инвазию злокачественных опухолей. Нерешенной актуальной задачей является выяснение механизмов появления активированных стромальных клеток на границе инвазивного фронта фибротического фокуса и дальнейшей их дифференцировки в миофибробласты. Известно, что активация различных клеточных типов, вносящих вклад в пул миофибробластов, сопровождается появлением экспрессии белка активации фибробластов альфа (FAPа). Этот же маркер описан для фибробластов, ассоциированных с опухолью (CAF), роль которых хорошо изучена в канцерогенезе, однако крайне мало известно о роли FAPа+ фибробластов в развитии фиброза. FAPа является мембранной протеазой, демонстрирующей экзо- и эндопептидазную активность, которая участвует в протеолизе ВКМ, облегчая инвазию клеток. С другой стороны, FAPа+ клетки способны к секреции ключевых белков профибротического ВКМ. Роль FAPа+ клеток в прогрессии фиброза на данный момент представляется весьма противоречивой. Ранее мы показали, что повреждение тканей легкого сопровождается появлением и накоплением FAPа+ клеток, что положительно коррелирует со степенью тяжести фиброза. Однако точный вклад FAPа+ клеток в ремоделирование фибротических фокусов и прогрессию или реверсию патологического фиброза остаётся неопределённым. В данном проекте впервые в фокусе внимания являются активированные стромальные клетки-предшественники миофиброластов (FAPа+ клетки) и получены новые данные об их роли в развитии прогрессирующего фиброза. На заключительном этапе проекта мы продолжили изучать клеточно-молекулярные механизмы дифференцировки этих клеток в миофибробласты, взаимодействия с белками ВКМ и клетками иммунной системы, влияния на ангиогенез, в том числе с учетом тканеспецифических различий стромальных клеток. С использованием полученных нами генетически модифицированных линий фибробластов человека с измененной экспрессией FAPа было установлено, что гиперэкспрессия FAPа ускоряет TGFβ-индуцированную дифференцировку как легочных, так и дермальных фибробластов в миофибробласты. При этом пролиферативный ответ на гиперэкспрессию FAPа оказался тканеспецифичным: выраженное усиление пролиферации наблюдалось в фибробластах легких, но не дермы. Данный эффект не зависит от ферментативной активности FAPа. Кроме того, гиперэкспрессия FAP увеличивает адгезивные свойства клеток, замедляя их открепление трипсином. Показано, что скорость направленной миграции фибробластов в большей степени зависит от состава ВКМ, взаимодействующего с мигрирующими клетками, чем от уровня экспрессии FAPа, что указывает на вторичную роль FAPа в этом процессе. В то же время, гиперэкспрессия FAPа в фибробластах легких приводила к подавлению их проангиогенной функции в модели кокультивирования с эндотелиальными клетками, что согласуется с выявленной ранее проангиогенной ролью нокаута FAPа в дермальных фибробластах. Исследование сигнальных путей в стромальных клетках с разной экспрессией FAPа выявило сложную тканеспецифичную регуляцию. В легочных фибробластах гиперэкспрессия FAPа ассоциирована с активацией пути PI3K-Akt (повышение p110 PI3K и pAkt/Akt, снижение PTEN). В дермальных фибробластах наблюдалась иная картина: подавление экспрессии PI3K на фоне снижения PTEN и повышения общего Akt. Также обнаружены различия в регуляции пути Hedgehog: в легочных фибробластах отмечены изменения уровня эффектора GLI1, а в дермальных – усиление процессинга лиганда Sonic Hedgehog (Shh). Методом иммунопреципитации с последующим масс-спектрометрическим анализом идентифицирован набор белков (включая компоненты ВКМ и пептидазы), потенциально взаимодействующих с FAPа, среди которых определены кандидаты в субстраты его эндопептидазной активности. Был подробно изучен вклад ферментативной активности FAPа в регуляцию стромальных клеток. Флуорометрический анализ подтвердил, что TGFβ-стимуляция приводит к повышению мембраносвязанной активности FAPа в фибробластах обоих типов. Однако секреция активной формы в культуральную среду оказалась тканеспецифичной: она усиливалась для легочных и подавлялась для дермальных фибробластах. В мышиной модели легочного фиброза, индуцированного блеомицином, обнаружено прогрессирующее нарастание общей активности FAPа в легочной ткани, коррелирующее с развитием фиброза. Эксперименты с селективными ингибиторами подтвердили вклад как FAPа, так и пептидазы PREP в измеряемую активность. Была изучена роль FAPа в контексте межклеточных взаимодействий и клеточной пластичности при фиброзе. На модели стромальных клеток орбитальной жировой ткани пациентов с эндокринной офтальмопатией показано, что как CD90+, так и CD90- субпопуляции способны к дифференцировке в миофибробласты и адипоциты, хотя CD90- клетки проявляют больший адипогенный потенциал. Изучены механизмы паракринного взаимодействия между этими субпопуляциями. Исследование на модели фиброза у мышей вида Acomys cahirinus, устойчивых к его развитию, показало отсутствие значимого накопления FAPа+ активированных фибробластов и миофибробластов в ответ на повреждение, в отличие от мышей линии Mus. Это указывает на критическую роль активации FAPа+ стромы в инициации фиброза. Изучение паракринного влияния макрофагов различных подтипов (M1, M2a, M2c) на фибробласты выявило сложную регуляцию: секретом M2c-макрофагов усиливал дифференцировку фибробластов в миофибробласты независимо от FAPа, а внеклеточные везикулы мезенхимальных стромальных клеток (ВВ МСК) модулировали этот процесс, влияя на поляризацию макрофагов. Также была продемонстрирована возможность регулирования уровня белка FAPа в фибробластах с помощью синтетических мимиков микроРНК (в частности, miR-30a, для которой FAPа является доказанным таргетом, и потенциальных регуляторов miR-5194 и miR-193). Таким образом, нами получены оригинальные данные о роли FAPа+ клеток в формировании и прогрессии фиброза, что в дальнейшем позволит сформулировать концепцию участия этих клеток в патогенезе фибропролиферативных заболеваний. Результаты проекта позволят расширить и углубить представление о механизмах репаративной регенерации в постнатальных тканях млекопитающих и стать основой для разработки новых подходов к лечению фиброзирующих заболеваний, в том числе фиброза легких.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".