Фундаментальные проблемы регенеративной медицины: регуляция обновления и репарации тканей человекаНИР

Fundamental issues of regenerative medicine: regulation of human tissue renewal and repair

Источник финансирования НИР

Хоздоговор, Р_ФАРМ
грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 13 апреля 2023 г.-31 декабря 2023 г. этап 1
Результаты этапа: Данный проект направлен на выяснение механизмов, лежащих в основе процессов обновления ниши стволовых клеток, гетерогенности стволовых клеток в составе такой ниши и способности этих клеток к направленной дифференцировке и предотвращению развития фиброза. В частности, в задачи проекта входит анализ влияния таких гормонов и нейромедиаторов как норадреналин, серотонин, инсулин и паратиреоидный гормон на самоподдержание МСК, а также коммитирование и дифференцировку этих клеток. В 2023 году для выяснения механизмов формирования контрактильного фенотипа МСК нами был проведен поиск факторов транскрипции, которые запускают и поддерживают этот процесс. Для этого мы провели углубленный биоинформатический анализ массивов данных о составе транскриптомов одиночных клеток. Непосредственный анализ экспрессии факторов транскрипции в таких массивах затруднен ввиду малой представленности их мРНК. Однако на активность факторов транскрипции в анализируемой клетке достоверно указывает повышение экспрессии регулируемых ими генов-мишеней. Поэтому для того чтобы выявить факторы транскрипции, которые могут управлять дифференцировкой МСК, мы проанализировали распределение известных мишеней факторов транскрипции. Для расчета регулонов (транскрипционный фактор вместе с регулируемыми им генами-мишенями) мы использовали метод SCENIC. С помощью такого подходы мы впервые обнаружили, что обработка МСК норадреналином приводит к повышению в них активности транскрипционных факторов, связанных с сократительной активностью клеток, например, MEF2C, NFATC3 и MEF2A. Более того, нам удалось впервые выявить увеличение экспрессии мишеней факторов транскрипции, которые не были описаны ранее как регуляторы сократимых клеток (TRPS1, BRF2, TBLXR1, MZF1, KLF11, MAFF). Наши данные указывают на участие перечисленных факторов в индукции контрактильного фенотипа МСК под действием норадреналина. Мы выявили спектр транскрипционных факторов, которые участвуют в самоподдержании МСК, в том числе KLF2, а также RARG, CREB5, POLR3G, JDP2 и NR2F6. В 2023 году нами были созданы линии иммортализованных МСК с помощью эктопической экспрессии кДНК теломеразы человека в них. Полученные линии иммортализованных клеток сохраняли иммунофенотип и функциональную активность (способность к дифференцировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях, а также чувствительность к гормонам и нейромедиаторам). Такие клетки были использованы для установления роли аденилатциклазы-1 в контроле дифференцировки МСК. При помощи CRISPR/Cas9 D10A-никазной системы мы получили линию клеток с селективным нокаутом этого белка. Используя полученную линию клеток, мы установили, что сигнальный каскад, инициируемый аденилатциклазой 1, необходим для индукции как остеогенной, так и адипогенной дифференцировок. Важной задачей проекта является выяснение механизмов взаимодействия МСК с их микроокружением, в том числе при старении, хроническом воспалении и фиброзе. В 2023 году для выяснения механизмов развития инсулинорезистентности при старении, мы проанализировали состав микроРНК во внеклеточных везикулах контрольных и сенесцентных МСК. С помощью анализа массива микроРНК с использованием веб-сервера sRNAtoolbox нами были выявлен спектр микроРНК, содержание которых повышено в везикулах старых клеток, включая микроРНК 19b и 29c. Среди мишеней микроРНК, характерных для везикул из сенесцентных клеток, мы обнаружили белки PTEN, MAPK1 и Ago1. Подавление экспрессии белка PTEN посредством микроРНК везикул сенесцентных клеток, может обусловливать наблюдаемое нами уменьшение ответа МСК на инсулин путем активации PI3K/AKT-зависимого пути внутриклеточной сигнализации. В результате исследований на модели старения эндотелия in vivo, вызванного системным введением ангиотензина II, мы выявили защитную роль Т-кадгерина в поддержании функциональной активности эндотелиальных клеток. С помощью биоинформатического анализа мы идентифицировали молекулярные мишени, экспрессия которых сопряжена с Т-кадгерином. Ими оказались бета-катенин, VE-кадгерин, N-кадгерин, кавеолин, AdipoR2 (рецептор адипонектина 2 типа), ДНК-метилтрансфераза 1, плакоглобин (поддерживает целостность эндотелиальных клеток сосудов и регулирует VEGF-индуцированное фосфорилирование VE-кадгерина) и ряд других белков. Мы предполагаем, что взаимная регуляция плагоклобина и Т-кадгерина может обусловливать защитное действие Т-кадгерина на эндотелиальные клетки. В рамках задачи по выяснению молекулярных механизмов взаимодействия МСК с клетками ниши сперматогониальных стволовых клеток на данном этапе проекта нами была исследована роль VEGF во взаимодействии МСК с клетками Лейдига и клетками Сертоли. На модели оценки секреторной активности клеток Лейдига показано, что секретом МСК стимулирует выработку тестостерона клетками Лейдига. При этом не наблюдается стимуляции пролиферации клеток Лейдига. Мы показали, что значимый вклад в реализацию эффектов секретома МСК на клетки Лейдига вносят растворимые факторы. Однако вопреки нашим ожиданиям, добавление нейтрализующих антител против VEGF, не снижало эффекта секретома МСК на клетки Лейдига. Это может указывать на необходимость присутствия других факторов для реализации эффектов VEGF. При развитии фиброза МСК в составе стромы находятся под воздействием различных стимулов от профибротического микроокружения, которые могут оказывать существенное воздействие как на клеточный субпопуляционный состав МСК, так и на состав их секретома. На данном этапе мы исследовали, как меняется секретом МСК и субпопуляций этих клеток в профибротическом микроокружении. Ранее в рамках проекта нами была разработана и валидирована модель профибротического микроокружения. Мы установили, что в ответ на профибротические стимулы часть МСК дифференцируется в миофибробласты, а другая часть имеет более высокие инвазивные свойства и сниженную способность к контракции матрикса. Вторая субпопуляция МСК, по данным биоинформатического анализа, может быть выделена с помощью сортировки по экспрессии PDGFRа. При анализе ответа субпопуляций МСК на культивирование в профибротических условиях, мы обнаружили, что секретом PDGFRα+ клеток обогащен белками внеклеточных везикул. Помимо этого, мы выявили в секретоме PDGFRα+ клеток еще несколько белковых паттернов, включая белки-регуляторы клеточной подвижности и адгезии, развития многоклеточных организмов, формирования тканей и сосудистой сети, ответа тканей на повреждение. На основании полученных данных мы предполагаем, что в профибротических условиях паракринные эффекты PDGFRα+ субпопуляции МСК могут быть обусловлены, во-первых, регуляцией функционирования белков, связывающих инсулиноподобные факторы роста, а во-вторых - регуляцией воспалительного ответа. Хроническое воспаление, ключевыми участниками которого выступают М2-макрофаги, является важнейшим патогенетическим звеном фиброза тканей. На данном этапе мы дополнительно исследовали, как М2-макрофаги могут влиять на способность МСК регулировать развитие фиброза. Культивирование МСК в условиях хронического воспаления и оксидативного стресса приводило к появлению маркеров сенесценции у МСК и снижению способности их ВВ подавлять TGFβ1-индуцированную дифференцировку фибробластов в миофибробласты. При дальнейшем культивировании МСК, обработанных КС-М2 или H2O2, в стандартных условиях в течение 14 дней происходило снижение секреции компонентов SASP IL-6 и MCP-1, при этом способность фракции ВВ секретома МСК подавлять TGFβ1-индуцированную дифференцировку фибробластов в миофибробласты восстанавливалась, что говорит о обратимости клеточной сенесцении МСК, развивающейся в условиях короткого воздействия сигналов, ассоциированных с повреждением, и возможном восстановлении регуляторных антифибротических функций МСК. Таким образом, в результате выполнения проекта были получены новые актуальные данные об участии МСК в обновлении и репарации тканей, а также о механизмах нарушения этих процессов при гормональных дисфункциях, старении и хроническом воспалении.
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. этап 2
Результаты этапа: -
3 1 января 2025 г.-31 января 2025 г. этап 3
Результаты этапа: С помощью оценки мобилизации внутриклеточного Са2+ и ингибиторного анализа мы впервые установили, что старение и развитие инсулинорезистентности приводят к критическим изменениям ответов МСК на воздействие гормонов. В ответ на действие инсулина в таких клетках возрастал вклад внутриклеточных сигнальных путей, опосредованных фосфолипазой С, в то время как активность «канонического» Akt-зависимого пути существенно снижалась. Наблюдаемые изменения сопровождались нарушением адипогенной дифференцировки и изменением состава секретома МСК С помощью анализа транскриптома одиночных клеток и комплексной биоинформатической обработки массивов данных мы сопоставили состав популяций МСК жировой ткани и надкостницы. Мы не обнаружили в них уникальных субпопуляций МСК. Однако при воздействии ПТГ в популяции МСК-ЖТ, в отличие от клеток надкостницы, возникает уникальный кластер клеток, которые отличаются повышенной активностью, но не экспрессией, таких факторов транскрипции как GATA2 и МSX1. Эти факторы, по-видимому, и переключают МСК-ЖТ в проостеогенное состояние, одновременно блокируя их адипогенную дифференцировку в ответ на действие ПТГ. В рамках изучения роли урокиназной системы в патогенезе старения эндотелия был проведен анализ экспрессии uPA и uPAR в тканях на модели эндотелиальной дисфункции, вызванной хроническим введением ангиотензина II. На основании полученных данных была предложена модель участия uPA и uPAR в активации сигнальных путей, связанных с воспалением, ремоделированием сосудов и регенерацией тканей. Для анализа регуляции активности МСК в эндометриальной нише гормонами, мы создали линию иммортализованных МСК эндометрия, стабильно экспрессирующих рецептор эстрогена (иМСКЭ-ESR1). Используя эту модель мы установили, что гиперэкспрессия ESR1 приводит к изменению секретома этих клеток, включая повышение экспрессии SFRP1 и TGFBI, и снижение - IGFBP5. Мы протестировали влияние секретома иМСКЭ-ESR1 на рост эндометрия у овариэктомизированных мышей. Ранее мы установили, что секретом МСК стимулирует восстановление сперматогониальной ниши, повышая секрецию тестостерона клетками Лейдига. Фактором, необходимым для реализации этого эффекта, оказался VEGF. На данном этапе мы установили, что в сперматогенной нише рецептор этого фактора, VEGFR2, находится в эндотелии и клетках сперматогенного дифферона, но не в клетках Лейдига, как мы предполагали ранее. Таким образом, мы установили, что секретом МСК действует на клетки Лейдига опосредовано, через другие клетки ниши, и эти механизмы еще предстоит установить. В рамках выполнения проекта мы охарактеризовали субпопуляцию МСК, устойчивую к профибротическому микроокружению как экспрессирующую PDGFRα (CD140a). Углубленный протеомный анализ PDGFRα+ и PDGFRα– субпопуляций показал, что секретом PDGFRα+ субпопуляции обогащён белками с антифибротическими, антиинвазивными и противовоспалительными свойствами, включая ингибитор металопротеиназы 3 (TIMP-3), лубрицин и аггрекан. Такой секреторный профиль свидетельствует о сниженных протеолитической активности и способности к ремоделированию внеклеточного матрикса у PDGFRα+ клеток. Напротив, секретом PDGFRα– МСК обогащен матриксными протеазами, включая ADAM9 и FAPα, и белками, которые стимулируют воспаление (CTGF, THBS1, ADAM10, ADAM9, CFB, CFD, CHI3L1, MIF и S100A4), а также про-фиброзными белками, включая COL5A2, витронектин и остеопонтин. Секретом PDGFRα+ субпопуляции напротив, обогащен такими противовоспалительными белками как дермицидин, десмогелин-1, LAMP-2, TIMP-3, sFRP-4 и SOD2. Это позволяет предположить, что PDGFRα+ МСК участвуют в подавлении воспаления. Таким образом, PDGFRα– МСК обладают признаками миофибробластов и характеризуются выраженной профибротической и инвазивной активностью, тогда как активность PDGFRα+ клеток направлена на подавление воспаления и фибротических изменений. 6. На модели блеомицин-индуцированного фиброза у трансгенных мышей PTHrP-CreERT мы изучили динамику накопления PTHrP+ клеток и их участие в развитии фиброза легких. Мы установили, что эти клетки преимущественно располагаются в эпителиальной выстилке, погибают после введения блеомицина, а затем восстанавливают свою численность. PTHrP+ клетки не содержат маркерных белков макрофагов (CD206), нейроэндокринных клеток (синаптофизина), клеток Клара (утероглобина) или миофибробластов (альфа-гладкомышечного актина). Частая со-локализация PTHrP+ клеток и CD206+ макрофагов указывает на взаимодействие этих клеток и позволяет предположить, что PTHrP+ клетки участвуют в развитии фиброза через паракринные взаимодействия с иммунными клетками. В рамках исследования нейропротективной активности секретома МСК на модели перинатальной гипоксии у крыс мы установили, что введение секретома МСК не влияет на результаты когнитивных и поведенческих тестов, однако может препятствовать формированию очаговых кист. Полученные результаты позволяют утверждать, что секретом МСК в перспективе может послужить основой для разработки подходов к патогенетической и реабилитационной терапии перинатальной гипоксии новорожденных. Мы исследовали развитие воспаления стенки кишечника у мышей нокаутных по гену Muc2. С помощью транскриптомного анализа было установлено, что в нарушении ниши эпителиальной стволовой клетки кишечника, ассоциированном с дефицитом Muc2, участвуют металлопротеазы, в частности, ММР7, а также провоспалительные цитокины.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".