В связи с техническими работами в центре обработки данных, возможность загрузки и скачивания файлов временно недоступна.
 

Нейрональные кальциевые сенсоры: новые механизмы регуляции функциональной активностиНИР

Соисполнители НИР

ИБП РАН Соисполнитель
ФИБХ РАН Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2012 г.-31 декабря 2012 г. Нейрональные кальциевые сенсоры: новые механизмы регуляции функциональной активности
Результаты этапа: Проект направлен на установление общих принципов регуляции функционирования белков семейства нейрональных Са2+-сенсоров (НКС). В качестве объектов исследования на первом этапе проекта (2012 год) выбрано несколько НКС, которые характеризуются совместной локализацией в фоторецепторных клетках сетчатки – белки активаторы гуанилатциклазы 1 и 2 (GCAP1 и GCAP2), рековерин, NCS1, а также универсальный Са2+-сенсор кальмодулин. Ввиду отсутствия в нашем распоряжении препарата NCS1, получена кДНК гена этого белка, на основе которой создана конструкция для экспрессии NCS1 в бактериальных клетках. Разработана методика отчистки NCS1 из бактериальных продуцентов, охарактеризованы спектр собственной флуоресценции и степень миристоилирования полученного белка. Все параметры рекомбинантного NCS1 соответствуют природному аналогу. Рекомбинантные препараты остальных НКС получены с использованием разработанных ранее генетических конструкций. Проведены сравнительные исследования эффективности и селективности действия отобранных НКС в отношении ферментов-мишеней при различных концентрациях кальция и магния, т.е. в условиях, соответствующих разным внутриклеточным состояниям. В частности, охарактеризовано действие этих белков на активность эффекторных ферментов фоторецепторных клеток, родопсинкиназы (GRK1, RK) и гуанилатциклазы E (GC-E). Установлено, что в то время как способностью модулировать активность GC-E обладают только GCAP1 и GCAP2, являющиеся доказанными природными регуляторами фермента, активность RK in vitro может регулироваться целым рядом НКС. Показано, что не только рековерин (до недавнего времени считавшийся уникальным регулятором RK), но и NCS1, а также кальмодулин в присутствии кальция способны ингибировать фосфорилирование зрительного рецептора родопсина под действием RK. Эффективность такого ингибирования убывает в ряду рековерин>NCS1>кальмодулин. Получены предварительные указания, что еще один НКС, GCAP2 способен активировать RK при снижении концентрации кальция до ~50 нM на фоне насыщающей концентрации магния (1 мМ), т.е. в условиях, возникающих в наружном сегменте фоторецепторной клетки под действием интенсивного светового облучения. С применением биосенсорного подхода показано, что GCAP2 непосредственно взаимодействует с RK, причем высокоаффинный участок связывания GCAP2 располагается в С-концевом регуляторном домене фермента (455-561) и не пересекается с участком 1-25, отвечающим за присоединение рековерина. Отмечено, что комплексы с RK образуют Mg2+-связанная (Kd=1,7x10-6) и Са2+-связанная (Kd=3x10-6) формы GCAP2, но не апо-форма белка. Установлено, что способность двух из исследуемых НКС, GCAP2 и рековерина, осуществлять, соответственно, позитивную или негативную регуляцию RK в значительной степени определяется присутствием в каждом из этих белков уникального С-концевого сегмента – участка, отличающегося вариабельностью структуры среди белков семейства. Так, с использованием химерных белков рековерина и GCAP2 показано, что введение С-концевого сегмента GCAP2 в структуру рековерина придает последнему способность активировать RK в отсутствие кальция, в то время как GCAP2 с интегрированным С-концевым сегментом рековерина приобретает свойства ингибитора RK при насыщающей концентрации катиона. Продемонстрированный обмен функциональными свойствами между рековерином и GCAP2 в ответ на введенные мутации является подтверждением выдвинутого нами ранее механизма регуляции функционирования НКС, а рамках которого С-концевой сегмент является последовательностью, определяющей специфичность действия этих белков в отношении внутриклеточных мишеней. Для завершения исследования этого механизма получены генетические конструкции для экспрессии еще двух химерных белков, GCAP1-С-Rc и NCS1-C-Rec, представляющих собой, соответственно, GCAP1 и NCS1 с интегрированным С-концевым сегментом рековерина. Проводится характеристика структурных изменений, а также изменений функциональной специфичности указанных НКС, обусловленных введенными мутациями.
2 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. Нейрональные кальциевые сенсоры: новые механизмы регуляции функциональной активности
Результаты этапа: Нейрональные кальциевые сенсоры (НКС) – семейство ключевых белков нервной ткани, способных преобразовывать сигналы Ca2+ в широкий спектр клеточных ответов за счет модуляции активности специализированных эффекторных мишеней. Основной задачей проекта является установление взаимосвязей между структурной организацией и функциональной специфичностью НКС с учетом влияния различных условий внутриклеточной среды. Исследования проводятся на примере НКС фоторецепторной клетки рековерина (Rc), белка активатора гуанилатциклазы 2 (GCAP2) и нейронального кальциевого сенсора 1 (NCS1). Принципиальным подходом, используемым для решения поставленной задачи, является выявление и изучение функциональной роли элементов структуры НКС, являющихся уникальными для каждого из этих белков (1 тип), или отличающихся консервативностью среди НКС (2 тип). К элементам первого типа относится С-концевой сегмент – участок структуры, расположенный вне кора белка, содержащего Са2+-связывающие центры, и различающийся среди НКС длиной, вторичной структурой, а также подвижностью и положением в молекуле белка. Ранее, на примере Rc и GCAP2, нами было установлено, что С-концевой сегмент обеспечивает селективность узнавания обоими НКС своих мишеней, причем введение С-концевого сегмента Rc в GCAP2 приводит к обращению указанной селективности. На этапе 2013 года с использованием белково-инженерного подхода показано, что Rc с интегрированным С-концевым сегментом от GCAP2 не меняет селективность действия, однако приобретает ряд специализированных функциональных свойств GCAP2, среди которых способность Сa2+-зависимым образом фосфорилироваться под действием циклонуклеотидзависимых протеинкиназ и способность взаимодействовать с клеточными мембранами в отсутствие Са2+. В отличие от вышеописанных эффектов, замена С-концевого сегмента в другом НКС – NCS1 – на соответствующую последовательность Rc не оказывает влияния на эффективность действия исходного белка, однако модифицирует механизм его Са2+/миристоильного переключателя, придавая NCS1 свойства Rc. Полученные данные указывают на ключевую роль вариабельного С-концевого сегмента НКС в обеспечении функционального разнообразия этих белков. К элементам структуры НКС второго типа относится консервативный среди белков семейства остаток цистеина (в Rc (C39) и NCS1 (C38) – единственный остаток такого типа), функция которого до начала проекта оставалась неясной. В 2013 году установлено, что в случае Rec, С39 локализуется на поверхности молекулы белка и придает ему чувствительность к изменению редокс-потенциала внутриклеточной среды, окисляясь в условиях ex vivo при интенсивном световом облучении сетчатки с образованием димерной формы dRc. Определена величина редокс-потенциала среды, способствующего образованию dRс. На основании полученных данных впервые проведена оценка величины редокс-потенциала фоторецепторной клетки. Наконец, в структуре большинства НКС обнаружен еще один элемент второго типа – последовательность “?xxxx?xx?” (? – остаток ароматической аминокислоты, x – остаток любой аминокислоты), являющаяся потенциальным сайтом связывания каркасного белка мембранных рафт-структур кавеолина-1 (Cav1). В 2013 году проведено клонирование и получение цитоплазматического домена F81–R101 Cav1 в виде фьюжн-белка с глутатион-S-трансферазой. Установлено, что домен F81–R101 Cav1 повышает сродство Rc к Са2+, что должно способствовать адаптации Са2+-чувствительности этого НКС к физиологическому диапазону концентрации катиона.
3 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Нейрональные кальциевые сенсоры: новые механизмы регуляции функциональной активности
Результаты этапа: Проект направлен на установление общих принципов функционирования белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров (НКС). В рамках Проекта на примере фоторецепторных НКС рековерина (REC), белка активатора гуанилатциклазы 2 (GCAP2) и нейронального кальциевого сенсора 1 (NCS1) установлены механизмы, определяющие специфику регуляторной активности структурно-сходных белков семейства, предотвращая конкуренцию между ними и обеспечивая широкий спектр опосредуемых ими клеточных эффектов. (1) Проведено сравнение специфичности действия НКС, в зависимости от условий внутриклеточной среды. Установлено, что для фоторецепторных НКС характерна разная степень селективности в отношении ферментов-мишеней каскада фототрансдукции – гуанилатциклазы E (GC-E) и родопсинкиназы (RK). В то время как способностью модулировать GC-E обладает только GCAP2, активность RK in vitro ингибируется всеми тремя белками, причем эффективность их связывания с ферментом и действия на его активность убывает в ряду REC>NCS1>>GCAP2. Выявлены различия в механизмах и условиях взаимодействия этих белков с фоторецепторными мембранами. Так, REC и NCS1 связываются с мембранами за счет N-концевой миристоильной группы (т.н. Са2+-миристоильного переключателя), при этом в первом случае взаимодействие является Са2+-зависимым и обратимым, а во втором – менее чувствительным к Са2+ и необратимым. Связывание GCAP2 с мембранами не зависит от миристоильной группы и присутствия Са2+, однако контролируется за счет фосфорилирования белка под действием циклонуклеотидзависимых протеинкиназ. Аффинность REC и GCAP2 к фоторецепторным мембранам определятся также гетерогенностью состава последних, в частности, наличием в них устойчивых к детергентам микродоменов, т.н. рафт-структур. Установлено, что НКС обладают разной чувствительностью к изменениям редокс-потенциала внутриклеточной среды. REC и NCS1 способны окисляться in vitro с образованием дисульфидных димеров (dRс и dNCS1) или окисленных мономеров (характерно для REC). REC димеризуется преимущественно в Са2+-связанной форме, NCS1 – в бескальциевой форме, в то время как окисление GCAP2 приводит к интенсивной мультимеризации белка и происходит вне зависимости от Са2+. В случае REC окисление приводит к нарушению структуры белка, а также к подавлению его мембранной ассоциации и регуляторной активности в отношении RK. Показано, что окисление REC происходит ex vivo и in vivo – в условиях светоиндуцируемого окислительного стресса. При этом образуются dREC, дисульфидные мультимеры/агрегаты REC, а также его смешанные дисульфидные формы, содержащие тубулин и некоторые другие белки. Накопление таких REC-содержащих форм ассоциировано с дегенерацией фоторецепторных клеток. Определено значение редокс-потенциала пары dREC/REC in vitro, на основе которого проведена оценка светозависимых изменений редокс-потенциала в цитоплазме фоторецепторной клетки. (2) Установлена взаимосвязь между функциональной специфичностью НКС, и их структурной организацией. С использованием белково-инженерного подхода показано, что селективность действия REC, GCAP2 и, в некоторой степени, NCS1 в отношении ферментов-мишеней регулируется при участии их С-конецвого сегмента – вариабельного среди НКС мотива, структура которого определяет доступность и сродство участков связывания мишеней в молекуле белка. С-конецвой сегмент GCAP2 дополнительно вовлечен во взаимодействие белка с мембранами и содержит сайт фосфорилирования, за счет которого обеспечивается чувствительность мембранной локализации GCAP2 к действию сигнальных протеинкиназ. В случае NCS1 С-конецвой сегмент модулирует Са2+-миристоильный переключатель, блокируя обратный захват миристоильной группы при диссоциации Са2+ и, тем самым, обеспечивая необратимость мембранной локализации белка. Способность НКС взаимодействовать с мембранными рафтами в значительной степени обусловлена присутствием в этих белках потенциального сайта связывания кавеолина-1 (Сav1) – основного интегрального компонента рафт-структур. Так, REC и GCAP2 образуют комплекс с ответным участком цитоплазматического домена Cav1, что не оказывает влияния на регуляторную активность этих НКС, но способствует их мембранной ассоциации. Кроме того, в случае REC взаимодействие с Cav1 повышает исходно низкое сродство белка к Са2+, что может способствовать адаптации его Cа2+-чувствительности к физиологическому диапазону концентрации катиона. Специфика редокс-чувствительности НКС определяется положением в молекуле каждого из этих белков консервативного остатка цистеина (C39 в REC, С35 в GCAP2, С38 в NCS1). C39 в REC и С38 в NCS1, являясь единственными остатками такого типа, располагаются на поверхности, соответственно, Са2+-связанной и бескальциевой форм этих белков, что согласуется с преимущественным окислением именно этих форм. В отличие от REC и NCS1, GCAP2 содержит три поверхностных остатка цистеина (включая С35), что может лежать в основе более выраженной и Са2+-независимой реакции этого белка на повышение окислительно-восстановительного потенциала среды. Таким образом, описанные структурные механизмы обуславливают функциональное разнообразие НКС, определяя различную чувствительность этих белков к прямым (изменение концентрации Са2+, редокс-статуса среды) и опосредованным (фосфорилирование под действием сигнальных протеинкиназ) сигналам, а также обеспечивая компартментализацию с мишенями (цитоплазматическая/мембранная локализация, локализация в мембранных рафтах) и селективность их узнавания. Результаты Проекта имеют важное прикладное значение, поскольку впервые указывают на участие НКС в патологических процессах в сетчатке, связанных с окислительным стрессом, а также позволяют сформулировать возможные подходы к селективному подавлению аберрантной активности NCS1, ассоциированной с заболеваниями ЦНС.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".