Адресные наногибридные материалы для терапии и диагностики онкологических патологийНИР

Targeted nanohybrid materials for therapy and diagnostics of oncological pathology

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 31 мая 2017 г.-31 декабря 2017 г. Адресные наногибридные материалы для терапии и диагностики онкологических патологий
Результаты этапа: На первом этапе выполнения работ были синтезированы наночастицы оксида железа со средним диаметром до 10, 20 Проект № 17-14-01316/2017 Страница 2 из 24 и 30 нм методом термического разложения из ацетилацетоната железа. Для получения наночастиц со средним диаметром меньше 10 нм методом термического разложения прекурсора в высококипящем органическом растворителе взвесили 3 ммоль ацетилацетоната железа (III) и ввели в трехгорлую колбу в атмосфере аргона, содержащую 20 мл диоктилового эфира и 3 ммоль олеиновой кислоты (0,96 мл) при 100 оС. Полученный раствор медленно нагрели со скоростью 3 оC/мин до кипения и кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов. После охлаждения смесь смешали с 100 мл ацетона и выпавшие наночастицы собрали магнитной декантацией. Собранный осадок редиспергировали в хлороформе. Для получения наночастиц со средним диаметром от 10 до 20 нм методом термического разложения прекурсора в высококипящем органическом растворителе взвесили 2,2 ммоль синтезированного ацетилацетоната железа (III) и 12 ммоль олеиновой кислоты и растворили в 10 мл 1-октадецена в трехгорлой круглодонной колбе на 100 мл. Затем систему нагрели до 320 оC в атмосфере аргона и интенсивного перемешивания со скоростью нагрева 3,3 оC/мин с обратным холодильником и термометром. После этого систему выдержали при температуре 60 минут с последующим охлаждением до температуры окружающей среды. Смесь поставили на магнитную декантацию с изопропанолом для отделения наночастиц магнетита с неодимовым магнитом. После слива декантата осадок трижды промыли изопропанолом. Наконец осадок повторно диспергировали при обработке ультразвуком. Для получения наночастиц со средним диаметром до 30 нм методом термического разложения прекурсора в высококипящем органическом растворителе применили двухстадийный синтез. На первой стадии взвесили 2,2 ммоль ацетилацетоната железа (III) и 12 ммоль олеиновой кислоты и растворили в 10 мл 1-октадецена в трехгорлой круглодонной колбе на 100 мл. Затем систему нагрели до 320 оC в атмосфере аргона и интенсивного перемешивания со скоростью нагрева 3,3 оC/мин с обратным холодильником и термометром. После этого систему выдержали при температуре 60 минут с последующим охлаждением до температуры окружающей среды. Смесь поставили на магнитную декантацию с изопропанолом для отделения наночастиц магнетита с неодимовым магнитом. После слива декантата осадок трижды промыли изопропанолом. Осадок повторно диспергировали при обработке ультразвуком в октадецене. На второй стадии 70 мг наночастиц оксида железа в 5 мл октадецена, полученных на первой стадии ввели в трехгорлую колбу на 100 мл. Затем туда же ввели 0,32 г олеиновой кислоты. Полученную смесь поставили нагреваться до 320 оС со скоростью 4 оС/мин в атмосфере аргона при интенсивном перемешивании. 1,2 г ацетилацетоната железа (III) растворили в 6 мл октадецена, полученный раствор набрали в шприц и с помощью инфузионного насоса ввели в кипящий раствор наночастиц оксида железа со скоростью 1 мл в час. После этого систему выдержали при температуре 60 минут с последующим охлаждением до температуры окружающей среды. Смесь поставили на магнитную декантацию с изопропанолом для отделения наночастиц магнетита с неодимовым магнитом. После слива декантата осадок трижды промыли изопропанолом. Наконец осадок повторно диспергировали при обработке ультразвуком. Модификацию поверхности синтезированных магнитных наночастиц с использованием 3- аминопропилтриэтоксисилана проводили по следующему протоколу: Для наночастиц оксида железа меньше 10 нм брали 11 мл раствора наночастиц с концентрацией 10 мг/мл перемешали с 22 мл раствора бромид цетилтриметиламмония (ЦТМА) и интенсивно озвучили на ультразвуковом щупе до образования однородной эмульсии. Затем хлороформ упарили на ультразвуковой бане при 55 оС. Полученный раствор наночастиц разбавили 400 мл воды. Затем туда добавили 2,5 мл 2 М раствора NaOH и систему нагрели до 70 оС. После чего туда быстро ввели 2,5 мл тетраэтоксисиликата и 22,5 мл этилацетата при интенсивном перемешивании. Через 10 минут добавили 1 мл 3-аминопропилтриэтоксисилан и система перемешивалась еще в течение 3 часов. Модифицированные наночастицы сконцентрировали центрифугированием в режиме 6000 rpm в течение 90 мин с 0,25 мг/мл по магнетиту до 9,2 мг/мл. Для модифицирования наночастиц оксида железа с диаметром от 10 до 20 нм взяли 11 мл раствора наночастиц с концентрацией 10 мг/мл перемешали с 22 мл раствора ЦТМА и интенсивно озвучили на ультразвуковом щупе до образования однородной эмульсии. Затем хлороформ упарили на УЗ бане при 55 оС. Полученный раствор наночастиц разбавили 400 мл воды. Затем туда ввели 2,5 мл 2 М раствора NaOH и систему нагрели до 70 оС. После чего туда быстро ввели 2 мл тетраэтоксисиликата и 45 мл этилацетата при интенсивном перемешивании. Еще через 10 минут также добавили 1 мл 3-аминопропилтриэтоксисилан, после чего система перемешивалась еще в течение 3 часов. После синтеза наночастицы сконцентрировали центрифугированием в режиме 6000 rpm в течение 90 мин с 0,25 мг/мл по магнетиту до 9,2 мг/мл. Для модифицирования наночастиц оксида железа с диаметром до 30 нм 11 мл раствора наночастиц с концентрацией 10 мг/мл перемешали с 22 мл раствора ЦТМА и интенсивно озвучили на ультразвуковом щупе до образования однородной эмульсии. Затем хлороформ упарили на уз бане при 55 оС. Полученный раствор наночастиц разбавили 400 мл воды. Затем туда ввели 2,5 мл 2М раствора NaOH и систему нагрели до 70 оС. После чего туда ввели быстро 2 мл тетраэтоксисиликата и 45 мл этилацетата при интенсивном перемешивании. Еще через 10 минут также добавили 1 мл 3- Проект № 17-14-01316/2017 Страница 3 из 24 аминопропилтриэтоксисилан, после чего система перемешивалась еще в течение 3 часов. После синтеза наночастицы сконцентрировали центрифугированием в режиме 6000 rpm в течение 90 мин с 0,25 мг/мл по магнетиту до 9,2 мг/мл. Для определения формы и размеров полученных наночастиц оксидов железа использовали метод просвечивающей электронной микроскопии, в том числе высокоразрешающей, на микроскопе JEM – 2100 фирмы JEOL. Исследовали порошки методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) в режиме «светлого» поля с ускоряющим напряжением 200 кВ. Для исследования образцов методом просвечивающей электронной микроскопии были приготовлены коллоидные растворы наночастиц в воде. Для избавления от конгломератов взвесь подвергали ультразвуковой обработке в течение 15 минут при комнатной температуре, далее полученный раствор отстаивали в течение 5 минут для осаждения крупных частиц. С помощью пипетки 1 мкл раствора частиц наносили на углеродную пленку на медной сеточке диаметром 3,05 мм, которая далее сушили на воздухе. Поскольку пленки на медных сетках аморфные, то брегговские отражения от них могут быть исключены, а при малых толщинах они считаются прозрачными для электронов, благодаря чему возможно точное исследование структуры и морфологии наночастиц. Фазовый анализ исследуемых материалов для определения параметров кристаллической структуры был проведен на дифрактометре ДРОН-4 (CoKα излучение с λ = 0,179 нм, u = 40 кВ, I = 30 мА, трубка работала в стандартном режиме), в процессе съемки использовали: 1 мм – приёмная щель на окружности гониометра и 1 мм – приемная щель счётчика; графитовый монохроматор; значение дифракционных углов 2θ менялись от 20° до 120° с шагом съемки 0,1°; экспозиция на точку съёмки – 3 с. Для анализа использовали специальные кюветы, в которые насыпали порошок и уплотняли его с добавлением спирта, что позволяло избегать появления лишних линий (от связующего вещества) и снизить уровень фона. Такие приспособления увеличивают чувствительность и точность анализа, что позволяет получать четкие дифракционные картины. Определение распределения частиц по размерам и измерения ζ-потенциала проводили на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (угол 173°) с применением He-Ne лазера. Для измерения размеров частиц в растворе, жидкий образец вводили в стандартной прозрачной кювете, которая подвергалась лазерному излучению с длиной волны 633 нм. Рассеяние частицами света отслеживается с помощью детектора. Скорость частиц и их размер рассчитывается на основе анализа флуктуации интенсивности рассеянного света. Для каждого образца проводится не менее 3-х экспериментов с 10-15 измерениями в каждом. Дзета-потенциал использовали для оценки стабильности суспензий: флокуляция и осаждение будет происходить в том случае, если электрическое отталкивание между частицами не превышает Ван-дер-Ваальсовы силы. Частицы с дзета-потенциалом большими, чем 30 мВ или меньшими, чем минус 30 мВ считаются стабильными. Мёссбауэровские исследования на ядрах 57Fe проводили при комнатной температуре на спектрометре MS-1104Em в геометрии пропускания, источник излучения – 57Co в матрице Rh. Путём обработки мёссбауэровских спектров по программе Univem MS определяли значения эффективных магнитных полей Hэфф на ядрах Fe57, изомерные сдвиги сигма-s и квадрупольные расщепления Δ элементарных спектров, а также относительную интенсивность (площадь) последних. Погрешность измерения величины Heff составляла ±5 кЭ (0,4 МА/м); сигма-s – 0,01-0,02 мм/с;сигма-s – ±0,01 мм/с, площади компонент – ±0,6 %. Для измерения отношения концентраций железа к кремнию проводили элементный анализ методом атомно- эмиссионной спектроскопии (АЭС) на атомно-эмиссионном спектрометре 4200 MP–AES. Данный метод основан на возбуждении атомарной эмиссии нагревом в плазме с последующим детектированием интенсивности излучения, позволяющим количественно измерить содержание элементного железа и кремния в аналите. Предварительно для измерения концентрации приготовили 2 серии из 5 стандартов путем разбавления стандарта по железу для ICP с концентрацией 1000 мг/л железа (III) и в 5% азотной кислоте и по кремнию с концентрацией 998 мг/мл в 0,1 М плавиковой кислоте. Оба стандарта разбавили деионизованной водой до 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мг/л по железу (III) и кремнию каждый. Объем каждого стандарта составил не менее 10 мл. После построения калибровочной кривой выполнили измерения концентраций в растворах, полученных растворением образцов в концентрированной соляной кислоте. Магнитные измерения проводили с помощью установки для измерения физических свойств “Quantum Design” Physical Property Measurement System (PPMS) (магнитное поле – до 7100 кА/м (90 кЭ), температура – от минус 271 до 76 °C), оборудованной вибромагнетометрической вставкой (VSM) (диапазон температур: 5,5 1273 °C, напряженность магнитного поля: до 1830 кА/м (23 кЭ), частота вибраций – 82 Гц, амплитуда вибраций – 1,5 мм, относительная погрешность измерений – не более 1 %). Исследуемый образец в виде порошка после предварительного взвешивания засыпали в полипропиленовую кювету, которую помещали в латунный держатель образца на 35 мм от конца держателя. После присоединения к длинному карбоновому вибрационному стержню, держатель опускали в камеру для образца, другой конец этого стержня находился при комнатной температуре. Далее задавали необходимые параметры исследования и запускали измерения. Мотор, который находится вне криостата, создавал вертикальные колебания стержня с образцом (амплитуда таких колебаний составляла 2 мм, а частота – 40 Гц). Образец на платформе должен Проект № 17-14-01316/2017 Страница 4 из 24 быть ближе к середине измерительной катушки. При колебаниях в измерительной катушке задается переменное напряжение пропорциональное магнитному моменту образца (с такой же частотой), которое измерялось синхронным детектором. Температуру образца определял поток паров гелия. Температура контролировалась несколькими термопарами, которые размещены на дне и наверху измерительной катушки. Магнитное поле, создаваемое соленоидом, определялось по силе тока источника. Удельную намагниченность модифицированных наночастиц измеряли при комнатной температуре с помощью вибрационного магнитометра в магнитном поле 2,2 МА/м. ИК-спектры записывали на инфракрасном Фурье-спектрометре Nicolet 6700 (Thermo Electron Corporation) с приставкой НПВО Smart Orbit with Diamond crystal, область сканирования спектров НПВО 400-4000 см-1, число сканирование 64- 192. Термогравиметрический анализ (ТГА) исследуемых образцов проводили на синхронном термоанализаторе Netzsch STA 449 F3. STA 449 F3 Jupiter и TGA/DSC1 термогравиметрическом анализаторе (Mettler Toledo). В ходе работы основным требованием к проводимым измерениям было точное определение массы. Точность определения массы составляла 0,001 мг при любой исследуемой температуре. Образцы нагревались в алундовых тиглях в токе аргона от 50 до 800 °С со скоростью нагрева 10 °С/мин. Получаемый при измерении исходный сигнал – зависимость дифференциальной термо-ЭДС (в мкВ) от температуры (в ºС). Сигнал может быть преобразован в зависимость удельного теплового потока (в мВт/мг) от температуры (в ºС) при учёте калибровки по чувствительности и массы исследуемого образца. Для анализа результатов полученные зависимости строили в координатах тепловой поток (мВт/мг) – температура (ºС). Элементный анализ проводили на автоматическом анализаторе CHN РЕ 2400, II (PerkinElmer Inc.). Содержание ЦТМА в исходных наночастицах рассчитывали по разности масс. % углерода, определённых для наночастиц после обработки HCl и перед обработкой, при этом предполагалось, что ЦТМА удаляется в процессе обработки полностью. Содержание пептидов (после соответствующей модификации) рассчитывали аналогичным образом вычитая из масс. % углерода в продуктах реакции масс. % углерода по аналогии с (Demin A.M. et al., 2016). Для получения уреида (Рисунок 1) гидрохлорид дитретбутилового эфира L-глутаминовой кислоты (1,0 г, 3,38 ммоль) и триэтиламин (1,54, 11,09 ммоль)) растворяли в CH2Cl2 (30 мл), полученный раствор охлаждали до -78°С. К полученному раствору добавляли по каплям раствор трифосгена (341 мг, 1,15 ммоль) в 10 мл CH2Cl2. После добавления раствора трифосгена температура реакции была постепенно доведена до комнатной температуры, после этого раствор перемешивался ещё в течение 30 мин. Далее в реакционную смесь вносили раствор H-Lys(Z)-Ot-Bu (757 мг, 2,03 ммоль) и триэтиламина (283 мкл, 2,03 ммоль) в дихлорметане. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. После этого реакционную смесь разбавили 50 мл CH2Cl2, и промыли водой (2×100 мл). Объединенные органические фракции высушили над сульфатом натрия. Растворитель был удален при пониженном давлении. Дальнейшую очистку полученной фракции проводили методом колоночной хроматографии (1,5:1 гексан: этилацетат). Продукт был выделен в виде бесцветного маслянистого вещества (1 г., 79 %). Бензоксикарбонильную защиту сняли в токе водорода на палладиевом катализаторе. Третбутильную защиту сняли в 10% трифторуксусной кислоте в дихлорметане. Характеристика уреида выполнена методом спектроскопии ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). Спектры ЯМР 1 Н регистрировали на приборе Bruker Avance с рабочей частотой 400 МГц. В качестве растворителя использовали диметилсульфоксид-d 6. Химические сдвиги приведены в миллионных долях по шкале δ относительно гексаметилдисилоксана как внутреннего стандарта. Полученный ПСМА-специфичный лиганд охарактеризовали с помощью масс-спектрометрии. Работа проводилась на хроматомасс-спектрометре LCMS 8030. (Shimadzu, Япония), оснащенном электроспреем, в качестве источника ионизации, и тремя квадруполями. Для конъюгации лиганда ПСМА с поверхностью наночастиц оксида железа 2 ммоль α,ω-бис{2-[(3-карбокси-1- оксипропил)амино]этил}пропиленгликоля с М=6000 растворили в 50 мл обезвоженного ДМФА, после чего туда добавили 1,2 ммоль дициклогексилкарбодиимида и 1,1 ммоль N-гидроксисукцинимида. Раствор перемешивали в течение одного часа при комнатной температуре, после чего в раствор вводили 1 ммоль уреида ПСМА. Через 12 часов после интенсивного перемешивания раствор разбавили равным объемом воды и поставили на диализ против воды в диализный мешок с размером пор 2 кДа. Воду заменили 2 раза через 12 и 36 часов после начала диализа. Через 2-е суток после диализа диализат собрали и упарили на роторном испарителе под вакуумом до получения сухого остатка. 10 мг наночастиц оксида железа с амино-группами на поверхности редиспергировали в 2 мл натрий-фосфатного буфера, после чего туда же вводили 8 мкмоль конъюгата α,ω-бис{2-[(3-карбокси-1- оксипропил)амино]этил}пропиленгликоля с ПСМА-лигандом в 1 мл воды. Далее в полученный раствор ввели 20 мкмоль гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N’-этилкарбодиимида и 10 мкмоль N-гидроксисукцинимида. Раствор перемешивали на шейкере в течение 12 часов, после чего поставили на диализ против деионизованной воды в диализном мешке с размером пор 12-14 кДа. Воду заменили 2 раза через 12 и 36 часов после начала диализа. После Проект № 17-14-01316/2017 Страница 5 из 24 диализа раствор собрали и хранили в темном прохладном месте. Для конъюгации пептида CREKA с магнитными наночастицами использован аналогичный подход. Учитывая, что синтезированные наночастицы были стабилизированы ЦТМА, который может оказывать токсическое действие из-за способности вызывать денатурацию белков, что не позволяет использовать его в медицинской практике, проводили удаление данного стабилизатора по методике, описанной в (Kim J. et al., 2008). Для этого к коллоидным растворам магнитных наночастиц в воде (с концентрациями 2 мг/мл) добавили 1 N раствор HCl до рН 1,4. Полученные коллоидные растворы магнитных наночастиц на основе Fe3O4, синтезированных методом термического разложения из ацетилацетоната железа, покрытых SiO2 и модифицированных 3-аминопропилсиланом с диаметром до 10 нм и диаметром от 10 до 20 нм выдержали 3 ч при температуре 60 °С, при перемешивании на верхнеприводной мешалке. После чего наночастицы осадили при 19000 rpm в течение 15 мин. После проведения декантации наночастицы промыли водой (2 раза) и ацетонитрилом (1 раз). Для прививки на поверхность магнитных наночатиц пептида pHLIP использовали кросс-линкера эфир N-ε- малеимидокапроилоксисукцинимид (EMCS) (Рисунок 2). Полученные магнитные наночастицы после удаления ЦТМА диспергировали в ацетонитриле (3 мг/мл) для проведения дальнейшей реакции с EMCS. Для введения линкера EMCS добавили к суспензии магнитных наночастиц при перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки и инкубировали в течение 4 ч, мольное соотношение наноастицы:EMCS составило 7:1 (в расчёте на Fe3O4). После проведения реакции функционализированные наночастицы осадили внешним магнитом, промыли от не прореагировавшего реагента и побочных продуктов реакции ацетонитрилом (3 раза) и диспергировали в PBS до конечной концентрации 2 мг/мл. Для конъюгации с pHLIP через суспензию наночастиц барботировали Ar для удаления O2 и предотвращения образования димерных продуктов pHLIP-pHLIP в результате образования дисульфидных производных. После этого к суспензиям магнитных наночастиц добавили pHLIP в PBS в мольном соотношении EMCS:pHLIP 40:1 (в расчёте на ранее добавленное количество EMCS) при перемешивании на верхнеприводной мешалке в течение суток. Модифицированные pHLIP магнитные наночастицы осадили при использовании внешнего магнитного поля, промыли PBS (2 раза) и диспергировали в PBS для дальнейшего использования в in vitro экспериментах. Для получения карбоксилированного плюроника F127, 25 г плюроника, 0,3 г янтарного ангидрида, 0,5 г 4- диметиламинопирида и 0,5 мл триэтиламина растворили в 30 мл безводного 1,4-диоксана и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем систему разбавили равным объемом воды и поставили систему на диализ. Первый раз воду сменили через 12 часов, второй раз – через сутки. После диализа раствор упарили на роторном испарителе до постоянной массы. Раствор наночастиц оксида железа в хлороформе с исходной концентрацией 20 мг/мл разбавили толуолом до концентрации 2 мг/мл. 1,26 г карбоксилированного плюроника растворили в 50 мл воды при обработке ультразвуком в ультразвуковой бане. 2 мл раствора наночастиц оксида железа смешали с равным объемом раствора карбоксилированного плюроника и обработали ультразвуком до образования гомогенной эмульсии. Далее эмульсию разделили центрифугированием в режиме 12500 rpm в течение 10 минут, после чего органическую фазу слили и добавили воду. Полученную систему гомогенизировали ультразвуком и выделили осадок наночастиц, покрытых карбоксилированным плюроником путем центрифугирования в режиме 12500 rpm в течение 60 минут. Осадок редиспергировали в изотоническом натрий-фосфатном буфере с (pH 7.4). В 2 мл раствора наночастиц в буфере с концентрацией 0,32 мг/мл по оксиду железа добавляли 40 мкл раствора гидрохлорида доксорубицина с концентрацией 5 мг/мл, перемешивали и оставляли на ночь. На следующий день наночастицы выделяли центрифугированием в режиме 12500 rpm в течение 60 мин. Полученный осадок редиспергировали в изотоническом натрий-фосфатном буфере (pH 7.4). Уровень загрузки доксорубицина оценивали фотометрически. Предварительно строили калибровочную кривую по раствору гидрохлорида доксорубицина известной концентрации (1, 5, 10, 25, 50, 100 мкг/мл). В планшет на 50 лунок добавляли по 300 мкл калибровочных растворов в двух повторностях и по полученным данным строили калибровочный график. Аналогично в 2-х повторностях по 300 мкл измеряли концентрацию доксорубицина в аналите при длине волны 495 нм. По разнице концентраций доксорубицина в исходном растворе и супернатанте после загрузки определяли уровень загрузки. Т2 релаксивность определяли с помощью магнитно-резонансного томографа ClinScan с мощностью поля 7Т. Были получены МР-снимки пробирок, содержащих раствор образца, с известной концентрацией Fe3+ в режиме Spin Echo с параметрами TR=10000 мс, TE = 8, 16, 24, … , 240 мс. Далее оценивали интенсивность сигнала в каждой пробирке и вычисляли время Т2 по формуле: S_i=S_0 e^((-TE/T2)) (1) где S0 – сигнал в начальный момент времени, Si – сигнал в момент времени TE. T2 релаксивность при этом определялась как тангенс угла наклона линейной зависимости времени T2 от концентрации частиц. Проект № 17-14-01316/2017 Страница 6 из 24 Для разработки протокола исследования ферроптоза in vitro за основу брали метод, описанный в статье (Dixon S.J. et al., 2012). Для приготовления «обедненной» среды DMEM F12 температурно-инактивированную сыворотку диализовали (3500 MWCO) против натрий-фосфатного буфера (PBS, рН 7.4) при 4 оС со сменой буфера дважды через 4 и 16 часов, и фильтровали через 0.22 фильтр и вносили до концентрации 10% в DMEM F12 без добавления L-глутамина. Использовали клеточные линии MDA-MB231, PC-3, U87, 4T1 и режимы культивирования клеток: в 24-луночных плашках 105 клеток, в 96 луночных плашках 1х104 и 2 х104 клеток. Культивирование до внесения индукторов/ингибиторов ферроптоза проводили в «полной» среде DMEM F12 (с добавлением 10% FBS) и в «обедненной» среде DMEM F12. Для индукции ферроптоза использовали эрастин в конечной концентрации 10 мкМ. Для ингибирования ферроптоза использовали: 100 мкМ дефероксамин мезилат (DFO), 1 мМ ацетилцистеин (N-Acetyl-L-cysteine, NAC), 5 мМ глутатион (LGlutathione reduced, GSH). Оценку жизнеспособности проводили, используя МТТ-тест, окрашивание с трипановым синим методом микроскопии в камере Горяева, методом проточной цитометрии с 7-AAD. Количество клеток считали в камере Горяева и методом проточной цитометрии. Все планируемые на год работы выполнены полностью: да 1.4. Сведения о достигнутых конкретных научных результатах в отчетном году (до 5 стр.) Методом термического разложения из ацетилацетоната железа были получены и охарактеризованы наночастицы оксида железа с диаметром до 10 нм, от 10 до 20 нм и до 30 нм. По данным ПЭМ средний размер синтезированных наночастиц составил 9-10 нм, 18 нм и 28 нм соответственно (Рисунок 3). По результатам измерения методом динамического светорассеяния в хлороформе средний гидродинамический диаметр синтезированных наночастиц составлял около 12 нм, 20 нм и 110 нм соответственно (Рисунок 4). Методика химического модифицирования изначально гидрофобных наночастиц оксида железа, стабилизированных олеиновой кислотой, включает в себя промежуточную стадию перевода наночастиц в воду путем упаривания более легколетучего растворителя хлороформа и стабилизацией наночастиц ЦТМА – катионным ионогенным ПАВ. На поверхности изначально гидрофобных наночастиц адсорбируются положительно заряженные молекулы ЦТМА и придают им выраженный положительный заряд, что приводит к их стабилизации в водной среде. Наночастицы оксида железа размером до 30 нм не продемонстрировали агрегативную стабильность и после редиспергирования в хлороформе их гидродинамический размер составлял больше 100 нм (Рисунок 4С). Это может быть связано с большим значением магнитного момента наночастиц, вызывающим их агрегацию. По этой причине данный образец подвергать в дальнейшем химической модификации представлялось не целесообразным. По данным рентгеноструктурного анализа было выявлено, что образцы синтезированных наночастиц по структуре представляет собой обратную шпинель со средним размером кристаллитов 5 нм и 16 нм, соответственно (Таблица 1). Среди оксидов железа структура обратной шпинели наблюдается у маггемита (Fe2O3) и магнетита (Fe3O4). На основании данных термогравиметрического анализа (ТГА) наночастиц оксида железа было выявлено, что массовое содержание оксида железа у образца меньше 10 нм составило 64,84% , в то время как для образца от 10 до 20 нм – 73,37% (Рисунок 5). Для определения валентного состояния железа, полученные образцы наночастиц были исследованы методом мёссбауэровской спектроскопии. Образец наночастиц до 10 нм представляет собой преимущественно суперпарамагнитную фазу (Рисунок 6-А), в то время как наночастицы от 10 до 20 нм оказались преимущественно ферримагнитными (Рисунок 6-Б). Образец является нестехиометрическим магнетитом по фазовому составу. На последующей стадии покрытия 3-аминопропилсиланом, силаны гидролизуются с образованием кремниевых кислот, имеющих отрицательный заряд, адсорбируются на поверхности наночастиц оксида железа с образованием силоксановой оболочки, на поверхности которой в свою очередь присутствуют амино-группы. Можно наблюдать, что наночастицы по данным ПЭМ после химического модифицирования покрыты оболочкой (Рисунок 7). По данным исследования методом динамического светорассеяния средний размер наночастиц после покрытия составил около 50 нм и 40 нм, соответственно, для исходных наночастиц размером до 10 и от 10 до 20 нм (Рисунок 8). Дзета-потенциал наночастиц оксида железа после химического модифицирования составил +33 мВ, для наночастиц с диаметром магнитного ядра до 10 нм, и +30 мВ, для наночастиц с диаметром магнитного ядра от 10 до 20 нм. Данные ИК спектроскопии подтверждают наличие в наночастицах ядра на основе оксида железа (полоса в области 570 см-1) и оболочки на основе оксида кремния (широкая полоса в области 1050 см-1) (Рисунок 9). Исходные наночастицы содержали в качестве стабилизатора ЦТМА, наличие которого можно наблюдать на спектрах НПВО магнитных Проект № 17-14-01316/2017 Страница 7 из 24 наночастиц по наличию валентных колебаний С-Н связей (СН2) в области 2852 и 2921 см-1, а также N-С при 1412 см-1. О наличии NH2 и NH2+ групп можно судить по присутствию полос поглощения в области 1630 и 1530 см-1 соответственно (деформационные колебания N-H). Получены наногибридные материалы на основе наночастиц оксида железа со средним диаметром до 10 и от 10 до 20 нм и лиганада PSMA уреида, CREKA и pHLIP пептида. На рисунке 10 представлена структура лиганда к PSMA - уреида, содержащего остатки лизина и глутаминовой кислоты. Уреид был получен в три последовательные стадии: синтез изоцианата из ди-трет-бутилового эфира глутаминовой кислоты, его реакция с Z-защищенным лизином, снятие Z защиты и гидролиз сложноэфирной группировки. При этом в молекулу вектора ввели первичный амин, выступающий в роли спейсера для последующей прививки на модифицированную поверхность наночастиц. По данным спектра протонного магнитного резонанса (400 МГц, DMSO d6, δ, м.д.): 12.54 (уш.с, 3Н, СООН), 7.67 (уш.с., 3H, NH3+), 6.46-6.24 (м, 2Н, C(O)NH(urea)), 4.17-3.99 (м, 2H, CH), 2.82-2.67 (м, 2Н, СН2), 2.30-2.15 (м, 2H, CH2), 1.97-1.84 (м, 1H, CH2),1.77-1.60 (м, 2Н, СН2) 1.58-1.42 (м, 3H, CH2), 1.37 -1.26 (м, 2H, СН2)1.11-1.03 (м, 1H, CH2) - был получен целевой лиганд (Рисунок 11). По данным масс-спектрометрии в спектре наблюдается ион с отношением массы к заряду равным 320 а.е.м., что соответствует массе целевого ПСМА-специфичного лиганда (Рисунок 12). Методом карбодиимидной актвиации лиганд ПСМА ковалентно привит на поверхность наночастиц за счет конъюгации введённой в его структуру NH2 группы и СООН групп ω-бис{2-[(3-карбокси-1- оксипропил)амино]этил}пропиленгликоля, присутствующих на поверхности наночастицы в результате модификации. Для получения нанобиогибридного материала на основе синтезированных наночастиц оксида железа и CREKA-пептида использован аналогичный подход с формированием связи между N-концевой аминогруппой пептида и СООН группой на поверхности модифицированных ω-бис{2-[(3-карбокси-1-оксипропил)амино]этил}пропиленгликолем наночастиц. Связывание пептида pHLIP c поверхностью наночастиц оксида железа выполнено с использованием малеимидного кросс-линкера EMCS, обеспечивающего формирование ковалентной связи между SH-группой L-цистеина в составе молекулы пептида и NH2 групп на силанизированной поверхности наночастиц. В результате модификации EMCS и затем pHLIP в спектрах ИК можно наблюдать небольшое смещение и изменение формы и интенсивности полос поглощения: 2937 см-1 (валентные колебания С-Н), 1637 см-1 (Амид I) и 1534 см-1 (Амид II), что подтверждает иммобилизацию пептида на магнитных наночастицах (Рисунок 13). При этом полосы, характерные для ЦТМА в целевых продуктах отсутствуют, что может свидетельствовать об успешном удалении данного реагента с поверхности наночастиц. По данным элементного анализа на атомно-эмиссионном спектрометре концентрация по оксиду железа в золе после центрифугирования для наночастиц с диаметром до 10 нм составила 8,7 мг/мл, в то время как концентрация по оксиду кремния оказалась равна 15,3 мг/мл. Массовое содержание оксида железа в образце составило 36,25%. По данным элементного анализа на атомно-эмиссионном спектрометре концентрация по оксиду железа в золе после центрифугирования наночастиц с размером ядра от 10 до 20 нм составила 10,6 мг/мл, в то время как концентрация по оксиду кремния оказалась равна 5,6 мг/мл. Массовое содержание оксида железа в образце составило 65,43%. Такая разница в массовом содержании оксида железа связана с более развитой удельной поверхностью наночастиц размером меньше 10 нм и, соответственно, более активной адсорбцией кремниевых кислот на стадии химического модифицирования. Согласно данным CHN-анализа (по масс. % углерода) рассчитано количество органических молекул на поверхности магнитных наночастиц. Так, для исходных наночастиц оксида железа со средним диаметром до 10 и от 10 до 20 нм получены значения 0,155 и 0,096 ммоль ЦТМА в расчёте на г наночастиц соответственно. А содержание аминопропилсилана – 1,52 и 1,26 ммоль/г для наночастиц оксида железа со со средним диаметром до 10 и от 10 до 20 нм соответственно. На основании совокупности полученных данных, можно заключить, что поверхностная модификация чуть более эффективно протекает для магнитных наночастиц с размером магнитного ядра до 10 нм. Так, наночастицы оксида железа со средним диаметром до 10 модифицированные пептидом pHLIP содержали 4,62 мкмоль, а наночастицы со средним диаметром от 10 до 20 нм – 3,99 мкмоль пептида в расчёте на 1 г частиц. На рисунке 15 приведены данные ТГА анализа нанобиогибридного материала на основе магнитных наночастиц модифицированных пептидом pHLIP. На первом этапе происходит удаление физически адсорбированной воды до 160 °С. Удаление органического покрытия происходит на 2 стадии. На первой стадии (до 600 °С) происходит термодеструкция молекул аминопропилсилана, EMCS и pHLIP за счёт процессов декарбоксилирования и дезаминирования с выделение СО2, Н2О и NH3, что, видимо, приводит к образованию карбонизированного остатка. На следующей стадии (вплоть до 800 °С) происходит постепенное доокисление карбонизированного остатка за счёт примеси кислорода в аргоне или Fe3O4-ядра магнитных наночастиц с выделением СО2. Таким образом, наноматериал Проект № 17-14-01316/2017 Страница 8 из 24 на основе наночастиц с размером до 10 нм (МНЧ-1-pHLIP) содержал не менее 9,59 масс. % органического покрытия (суммарное количество молекул APS, EMCS и pHLIP), а на основе наночастиц размером от 10 до 20 нм (МНЧ-2-pHLIP) – не менее 5,57 масс. %. При этом на долю пептида в МНЧ-1-pHLIP приходится до 1,9 масс. % (по данным элементного анализа), а в МНЧ-2-pHLIP – до 1,6 масс. %. Отметим, что по данным дифференциального термического анализа (ДТА) выраженных энергетических эффектов при термодеструкции органического покрытия не наблюдается (Рисунок 14). После модификации наночастиц уреидом удельный прирост массы лиганда составил около 0,1 масс. %. Перемена массы практически не детектируется после модифицирования уреидом, что связано с малой молекулярной массой лиганда относительно наночастиц. Измерение МРТ-контрастных свойств синтезированных наночастиц оксида железа показало, что для образца с размером ядра меньше 10 нм скорость поперечной спин-спиновой релаксации равна R2 =149,74 (ммоль/с)-1, тогда как для образца с размером ядра от 10 до 20 нм скорость поперечной спин-спиновой релаксации составила R2 =240,64 (ммоль/с)-1 (Рисунок 15). На рисунке 16 представлены кривые удельной намагниченности (М) модифицированных 3-аминопропилсиланом наночастиц и, для примера, кривые для наночастиц с диаметром до 10 нм после обработки HCl и после модифицирования пептидом. Наблюдаемые отличия в намагниченности двух типов исследуемых частиц обусловлены разным диаметра магнитных ядер (до 10 и от 10 до 20 нм) и разной толщины немагнитного покрытия SiO2 на них, М составила 17 и 32 ему/г соответственно. Значительный наклон высокополевой части кривой намагничивания наночастиц с размером от 10 до 20 нм возможно обусловлен наличием малых частиц магнетита, размером порядка 2 нм. Важно, отметить, что максимальные значения М для модифицированных наночастиц до и после конъюгации с пептидом составили 18 и 17 ему/г и отличались между собой в пределах ошибки. Отработана методика загрузки противоопухолевых препаратов магнитных наночастиц на основе Fe3O4, синтезированных методом термического разложения из ацетилацетоната железа, покрытых SiO2 и модифицированных 3-аминопропилсиланом, для последующей оценки эффективности терапии опухолей с использованием адресных гибридных наноматериалов. В качестве модельного противоопухолевого препарата был использован доксорубицин. В качестве модификатора был выбран плюроник F127, имеющий в своей структуре гидрофобные участки полипропиленгликоля, в которые могут загружаться гидрофобные противоопухолевые препараты за счет физической адсорбции. Загрузка доксорубицина составила 15,1% для наночастиц диаметром до 10 нм и 12,3% для наночастиц от 10 до 20 нм по массе. В ходе разработки протокола для последующего исследования индукции ферроптоза наночастицами in vitro было установлено, что методы окрашивания с трипановым синим и проточной цитометрии с 7-AAD не позволяют сделать заключение об эффективности индукции/ингибирования ферроптоза в клеточной культуре (Таблица 2, 3). Это обусловлено тем, что данные методы дают информацию о жизнеспособности клеток, в той или иной степени сохраняющих свою структуру, тогда как клетки уже подвергшиеся деструкции не учитываются в анализе. Можно видеть, что число клеток в образцах после инкубации с эрастином значительно снижается, в то же время жизнеспособность рассчитанная по данным окрашивания с трипановым синим и методом проточной цитометрии не позволяет учесть данный параметр. В связи с этим нами был выбран МТТ-тест оценки жизнеспособности клеток, отражающий не только количество жизнеспособных клеток в образце, но и позволяющий учитывать изменения плотности культуры (Таблица 2, 3, 4). На основании анализа влияния исследуемых ингибиторов ферроптоза на жизнеспособность клеток in vitro, в том числе в присутствии эрастина, в качестве оптимального ингибитора ферроптоза нами был выбран N-ацетил-L-цистеин в конечной концентрации 1 мМ. Разработанный протокол исследования индукции ферроптоза наночастицами in vitro представлен в Приложении к отчету (Протокол).
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Адресные наногибридные материалы для терапии и диагностики онкологических патологий
Результаты этапа: На втором этапе выполнения проекта в 2018 г исследованы взаимодействия адресных наногибридных материалов на основе наночастиц оксида железа (MNPs) со средним диаметром до 10 и от 10 до 20 нм, на поверхности которых ковалентно привиты векторные молекулы уреид (PSMA), CREKA и pHLIP (Таблица 1) с клетками in vitro. В ходе выполнения второго этапа проект нами разработана методика получения наноматериалов, на основе магнитных наночастиц, содержащих в составе силоксановой оболочки флуоресцентную метку Cy5 (10С и 20С). Химическое модифицирование изначально гидрофобных наночастиц оксида железа стабилизированных олеиновой кислотой (согласно методике, описанной в отчете 2017 г.) реализовано через промежуточную стадию перевода наночастиц в воду путем упаривания более легколетучего растворителя хлороформа и стабилизацией наночастиц бромидом ЦТМА – катионным ионогенным ПАВ. Это достигается благодаря адсорбции катионов ЦТМА на поверхности изначально гидрофобных наночастиц, что приводит к возникновению выраженного положительного заряда и их стабилизации в водной среде. На последующей стадии покрытия АПТЭС и тетраэтоксиликатом, силаны гидролизуются с образованием поликремниевых кислот, имеющих отрицательный заряд, адсорбируются на поверхности наночастиц оксида железа с образованием силоксановой оболочки, на поверхности которой в свою очередь присутствуют аминогруппы. Аналогичным образом ведет себя и конъюгат АПТЭС-Cy5. Можно наблюдать, что наночастицы по данным ПЭМ после химического модифицирования покрыты оболочкой (Рисунок 5). По данным исследования методом динамического светорассеяния средний размер наночастиц после покрытия в обоих случаях составил около 30 нм и для 10С (Рисунок 6-А) и для образца 20С (Рисунок 6-Б). Дзета-потенциал наночастиц оксида железа после химического модифицирования составил +31 мВ, для образца 10С, и +33 мВ для образца 20С. Конъюгат АПТЭС-Cy5 был получен из красителя Cy5 и силана АПТЭС из-за образования амидной связи между аминогруппой АПТЭСа и NHS-эфиром Cy5, которые реагируют с очень высоким выходом в безводной среде ДМФА. Следует отметить, что присутствие следовых примесей воды может привести к гидролизу эфирных связей, как NHS-эфира, так и самого силана, и неспособности в дальнейшем формировать ковалентные связи на поверхности наночастиц. На следующем этапе полученные наночастицы 10С и 20С были модифицированы посредством гетеробифункционального ПЭГ и получены образцы 10СP и 20CP c размером магнитного ядра меньше 10 нм и от 10 до 20 нм, соответственно. Средний гидродинамический размер образца 10CP составил около 40 нм, также как и у образца 20СP (Рисунок 7). Полученные образцы были успешно использованы для конъюгации с векторными пептидами. Для ковалентной иммобилизации лиганда PSMA через малеимид на поверхности наночастиц его смешали с раствором 2-иминотиолана – реагента, селективно взаимодействующего с первичной аминогруппой лиганда с образованием сульфгидрильных групп, посредством которых на последующей стадии происходит ковалентная иммобилизация лиганда на поверхности пэгилированных наночастиц (Рисунок 3-А, Б). Синтез образцов с ковалентно иммобилизованным CREKA-пептидом на поверхности пэгилированных наночастиц был применен аналогичный подход с образованием ковалентной связи между сульфгидрильной группой пептида и малеимидом на поверхности модифицированных наночастиц (Рисунок 3-В). Далее процедурой многократной фильтрации через центрифужные фильтры образцы были очищены от побочных продуктов реакции и непрореагировавшего избытка ПЭГ, лиганда и других компонентов. Таким образом, был получены образцы наноматериалов с иммобилизованным лигандом PSMA 10СP-P и 20CP-P, и наноматериалы с иммобилизованным CREKA-пептидом 10СP-С и 20CP-С. Средний гидродинамический размер образца 10CP-P составил около 50 нм (Рисунок 8-А), в то время как средний размер образца 20СP-P – 58 нм (Рисунок 8-Б). Средний гидродинамический размер образца 10CP-С составил около 58 нм (Рисунок 9-А), также как и у образца 20СP-С (Рисунок 9-Б). Перед биологическими испытаниями образцов было выполнено удаление стабилизатора бромида ЦТМА. Средний гидродинамический размер для образцов 10СР и 20СР составил 90 нм (Рисунок 10-А) и 43 нм, также наблюдался пик в области 250 нм (Рисунок 10-Б); для образцов 10СP-P и 20CP-P – 80 нм (Рисунок 11-А) и 90 нм, также наблюдался пик в области 190 нм (Рисунок 11-Б); для образцов 10СP-С и 20CP-С – 90 нм (Рисунок 12-А) и 60 нм, также наблюдался пик в области 220 нм (Рисунок 12-Б). Полученные коллоидные растворы наночастиц были использованы для проведения дальнейших экспериментов in vitro. Цитотоксичность полученных образцов 10CP, 20CP, 10СP-P, 20CP-P, 10СP-С и 20CP-С была исследована на клеточных линиях глиобластомы крысы С6 и человека U87, рака простаты LNCaP и PC3, а также на астроцитах крысы с помощью МТТ-теста в диапазоне концентраций до 200 мкг/мл по оксиду железа. Во всем исследованном концентрационном диапазоне протестированные образцы не токсичны, т.е. коэффициент IC50 не определяется из экспериментальных данных (Рисунок 13-22). Отсутствие токсичности у наноматериалов также подтверждено тестом с флуоресцентным красителем Sytoxgreen, визуализирующим мертвые клетки (Рисунок 23-24). Согласно результатам сравнительного исследования эффективности связывания наноматериалов, конъюгированных с лигандом PSMA на клеточных линиях аденокарциномы простаты человека LNCaP, экспрессирующих PSMA, и его не экспрессирующих PС-3, подтверждена функциональная активность полученных наноматериалов 10СР-Р и 20СР-Р. Так, на рисунке 25 видно, что наночастицы с PSMA образуют большие скопления с погибшими клетками размером от десятков до сотен микрометров. Однако наночастицы не обнаруживаются внутри клеток ни на одной временной точке. Результаты иного характера наблюдаются в случае с инкубацией клеток LNCaP c образцом 10CP без PSMA (Рисунок 26). Скопления наночастиц наблюдаются, как внутри, так и снаружи и на поверхности клеток. По данным изображений, полученных для линии РС-3, инкубированной с наночастицами с лигандом PSMA и без него, различия не были выявлены, что указывает на отсутствие специфического связывания 10СР-Р/20СР-Р с клетками. На рисунке 27 приведены данные по интернализации линии РС-3 после инкубации с наночастицами 10CP. На данных изображениях выявлены скопления наночастиц внутри клеток РС-3 уже спустя 1 час после совместной инкубации. С течением времени размер данных скоплений увеличивается. Согласно данным по интернализации наночастиц образцов 10CP и 10CP-C в клетки С6 существенных отличий в динамике накопления наночастиц и распределении между наночастиц с иммобилизованным пептидом CREKA и без него не было обнаружено. Следует отметить, что с увеличением продолжительности инкубации наблюдается увеличение размеров скоплений внутри клеток линии С6 (Рисунок 28). Исследование взаимодействия наночастиц образцов 10CP и 10CP-C с клетками U87, показало, что существенных отличий в динамике их накопления и распределения не наблюдается (Рисунок 29). Аналогично, наблюдали тенденцию к увеличению размеров скоплений наночастиц внутри клеток. В ходе проведения экспериментов по интернализации, в которых участвовали четыре линии клеток, было выявлено, что внутри клеток линий РС-3, С6 и U87 обнаруживаются скопления наночастиц. Для культуры LNCaP не выявлено накопления наночастиц внутри живых клеток в случае инкубации с 10CP-P, но обнаружены большие скопления наночастиц с погибшими клетками. Также наблюдается накопление наночастиц без PSMA внутри клеток данной культуры, однако, менее выраженное по сравнению клетками линии PC-3. Согласно данным исследования ультраструктуры полученных клеточных клеточных срезов линий LNCaP, PC-3 и С6 было выявлено, что в клетках всех трех типов наблюдаются наночастицы после 6 часов инкубирования с золем образца 10CP-P - в случае линий LNCaP и PC-3, и 10CP-C – в случае с линией С6. Во всех исследованных срезах агрегаты наночастиц наблюдаются преимущественно в везикулах т.к. наночастицы окружены мембраной (Рисунок 30). Иммобилизация пептида pHLIP на поверхности наночастиц оксида железа со средним диаметром до 10 нм, модифицированных тетраэтоксисиликатом и АПТЭС, была выполнена с использованием кросс-линкера EMSC на первом этапе выполнения проекта (2017 г) согласно схеме (Рисунок 31) и были получены наноматериалы 10-рН и 20-рН, соответственно. Данные исследования цитотоксичности наноматериалов 10-pH и 20-рН приведены на Рисунке 32. Рассчитанные значения IC50 приведены в таблице 2. Выраженность негативных эффектов на жизнеспособность клеток зависела как от типа наноматериала, так и от типа клеток. Клетки опухолевой линии 4Т1 проявили более высокую чувствительность к воздействию наноматериалов. Так, согласно данным МТТ-теста, наноматериал 20-рН не оказывал выраженного цитотоксического эффекта на клетки линии 3Т3-L1 и MDA-MB231, но в концентрациях выше 50 мг/мл и продолжительности инкубации 48 часов снижал жизнеспособность клеток линии 4Т1 на 16-21 %. Наноматериал 10-рН проявил цитотоксический эффект в отношении клеток линий 4Т1 и 3Т3-L1. Для клеток неопухолевой линиии 3Т3-L1 жизнеспособность снижалась при концентрации наноматериала 75 мкг/мл и выше и длительности инкубации 48 часов, тогда как в отношении клеток линии 4Т1, согласно данным МТТ-теста, дозо-зависимое снижение жизнеспособности фиксировали уже через 24 часа инкубации во всем тестируемом диапазоне концентраций наноматериала (k24=-0,109; R224=0,67; p24=0,047 и k48=-0,304; R248=0,76; p48=0,025). Наблюдаемая в эксперименте зависимость эффективности захвата и цитотоксичности наноматериалов от типа клеток ранее обсуждалась в литературе (Patil, Adireddy et al. 2015) (Buzea, Pacheco et al. 2007). Так, более выраженное подавление жизнеспособности клеток опухолевой линии, по сравнению с неопухолевой линией макрофагальных клеток при инкубации с МНЧ ранее наблюдали в исследовании (Feng, Liu et al. 2018). При исследовании эффективности связывания 10-рН и 20-рН с клетками опухолевых (MDA-MB231, 4T1) и неопухолевой (3T3) линий при нормальном (7,4) и слабокислом значении pH (6,8) среды, статистически значимых различий между концентрацией железа в клетках, инкубированных с наноматериалом в среде с пониженным значением рН 6,8 и в среде с физиологическим значением рН (7,4) не наблюдали (Рисунок 33). Отсутствие рН-зависимого связывания наноматериалов с клетками вероятно обусловлено неспецифическими взаимодействиями пептида с SiO2 на поверхности магнитного ядра, что препятствовало встраиванию pHLIP в мембрану клетки. Интересно отметить, что наночастицы более эффективно проникали в клетки линии 3T3-L1, по сравнению с клетками линии 4Т1 и MDA-MB231. В целом, эффективность проникновения 20-pH в клетки обеих тестируемых линий возрастала с увеличением концентрации наноматериала (например, k=0,035; R2=0,97; p=0,002 и k=0,068; R2=0,97; p=0,002, для клеток линий 4T1 и 3T3-L1, соответственно), однако, согласно данным линейного регрессионного анализа цитотоксичность наноматериалов в отношении клеток не зависела от эффективности их проникновения в клетки. Так, например, в клетки линии 3T3-L1 наноматериал проникал более эффективно, по сравнению с клетками линии 4T1 (Рисунок 34). Тем не менее, клетки линии 4Т1 проявили более высокую чувствительность к исследуемым наноматериалам. Таким образом, в основе реализации негативного воздействия исследуемых наноматериалов in vitro, могло лежать вымывание ионов Fe2+ с поверхности наночастиц в среду или недостаточное удаление ЦТМА. В связи с этим в ходе дальнейших исследований образцы наноматериалов еще более тщательно отмывали от стабилизатора (согласно вышеописанной методике пэгилированных наночастиц). В связи с неудовлетворительными результатами тестирования функциональной активности наноматериалов 10-рН и 20-рН нами был модифицирован дизайн наноматериалов на основе наночастиц оксида железа, конъюгированных с пептидом pHLIP, и успешно проведена ковалентная иммобилизация pHLIP-пептида на поверхности пэгилированных наночастиц 10Р/20Р и 10CP/20CP. Иммобилизация пептида реализована за счет взаимодействия PEG с аминогруппой на поверхности наночастиц с образованием амидной связи и с меркаптогруппой pHLIP за счёт присоединения по двойной связи малеимидного цикла. Таким образом, были получены образцы 10Р-pH, 20Р-pH, 10СP-рН и 20CP-рН. В качестве дисперсионной среды при конъюгации с пептидом в работе использованы буферные растворы: HEPES (0,025 M, pH 7.5) или PBS (pH 7.4). Гидродинамические характеристики 10СP-рН, 20CP-рН, 10Р-pH, 20Р-pH представлены в таблице 3. Показано, что в концентрациях порядка 0,1-0,2 мг/мл как PEG-, так и pHLIP-модифицированные наночастицы способны образовывать достаточно устойчивые коллоидные растворы со средним диаметром частиц (Dh) порядка 200 нм, имеющим слабо отрицательный поверхностный заряд. По данным релаксометрии рассчитаны коэффициенты релаксивности r1 и r2 (Рисунок .35). Коэффициенты релаксивности (r2) 10P-рН и 20P-рН составили 201 и 227 ммоль−1 с−1, соответственно. В целом, используемый для модификации способ синтеза позволяет предотвратить десорбцию и удаление PEG или пептида в биологических средах и служит гарантией сохранения получаемого наноматериала своей структуры. Данные ИК спектроскопии подтверждают наличие в целевых наночастицах ядра на основе оксида железа (полоса в области 580-590 см-1) и оболочки на основе оксида кремния (широкая полоса в области 1072-1083 и 953-962 см-1), в этой же области находятся и полосы поглощения, характерные для полиэтиленгликоля (валентные асимметричные и симметричные колебания С-О-С) (на Рисунок 36 А для примера приведены ИК спектры 10СР-MCA, 20СР-MCA и 10СP-рН, 20CP-рН, полученных по первому пути модификации (в соответствии со схемой представленной на Рисунке 31). В результате модификации PEG и затем pHLIP в спектрах ИК можно наблюдать небольшое смещение характерных для пептида полос поглощения продуктов модификации в сравнении с полосами поглощения pHLIP при сохранении формы и относительной интенсивности соответствующих полос (Рисунке 36 Б): 1650 см-1 (Амид I) 1545 (Амид II) и 1467 см-1 (Амид III), что, несомненно, подтверждает иммобилизацию пептида на наночастицах. По данным элементного анализа (по масс. % азота) рассчитано количество молекул ЦТМА и, исходя из найденного значения, рассчитано количество ОА на поверхности исходных MNP-10 и MNP-20 (Таблица 4). Аналогичным образом, но по разнице масс. % С в 10Р/20P и MNP-10/MNP-20 рассчитаны приблизительные количества органического слоя (APS-PEG-NH2). Также, по разнице масс. % С в 10P-рН, 20P-рН и 10Р/20P найдены приблизительные количества пептида на поверхности MNPs, полученных по первому пути синтеза. Полученные материалы охарактеризованы данными ТГА (Рисунок 37 А-Г). Сводные данные об общей потери массы образцов представлены в таблице 5. В целом, по данным ТГА можно заключить, что наноматериалы полученные на основе 20Р имеют большую степень модификации ПЭГ-производными и, возможно, пептидом. Однако точно рассчитать содержание каждого компонента не представляется возможным по причине сложности химического состава покрытия. Кроме того, сравнивая содержание органического покрытия в 10P-pH/20Р-рН и, например, 10Р/20P, можно отметить общее снижение его содержания. Это может быть объяснено частичной десорбцией стабилизаторов (ЦТМА и OA) в процессе проведения реакций модификации и обработки получаемых наноконъюгатов. Ввиду этого, данные о количестве PEG и pHLIP, рассчитанные по данным элементного анализа, тоже можно считать приблизительными. Результаты исследования цитотоксичности полученных образцов 10P-pH, 20Р-рН в диапазоне концентраций до 200 мкг/мл в отношении клеточных линий 4T1, MDA-MB231, 3T3 L1 методом МТТ-теста и методом проточной цитометрии с Sytoxgreen представлены на рисунках 38-42. Во всем исследованном концентрационном диапазоне коэффициент IC50 не определяется для наночастиц из опытных данных, что позволяет заключить, что образцы не токсичны. Флуоресцентно-меченые аналоги пэгилированных наночастиц, на поверхности которых иммобилизован пептид pHLIP (10СP-рН и 20CP-рН) также были нетоксичны в отношении клеток исследуемых линий (Рисунок 43, 44). Показано, что наноматериалы не оказывают цитотоксического действия на моноциты периферической при инкубации в течение 24 часов (Рисунок 45). Таким образом, полученные в ходе выполнения проекта наноматериалы могут быть признаны безопасными по данным in vitro исследований. Эффективность связывания флуоресцентно-меченных наноматериалов 10СP-рН, 20CP-рН с клетками оценивали методом проточной цитометрии после инкубации с наноматериалами при рН 6,8 и 7,4 соответственно. Было показано, что наноматериалы 10СP-рН и 20CP-рН эффективно связывались с клетками при рН 6,8, тогда как при рН 7,4 проникновение наночастиц в клетки было незначительным. Это свидетельствует о рН-зависимом pHLIP-опосредованном связывании наноматериалов с клетками. Так на рисунке 46 приведены результаты эксперимента на клетках линии 4T1. При инкубации наноматериалов 10СP-рН и 20CP-рН в концентрации 50 мг/л с клетками при рН 6,8 в течение 1 часа процент Су5-позитивных клеток был статистически достоверно выше (7,6 и 16,7 % для 10СP-рН и 20CP-рН, соответственно), чем в клетках, проинкубированных с наноматериалами при рН 7,4 (3.3 и 3.2 %, для 10СP-рН и 20CP-рН, соответственно). Таким образом, полученные наноматериалы функционально активны и перспективны для дальнейших исследований in vivo. Важно отметить, что инкубация при рН 6,8 не оказывала влияние на жизнеспособность клеток (Рисунок 47). В результате исследования способности синтезированных наноматериалов на основе наночастиц оксида железа (MNPs) со средним диаметром до 10 и от 10 до 20 нм, индуцировать ферроптоз в опухолевых клетках in vitro было показано, что исследуемые наноматериалы 10СР-pH и 20СР-рН не вызывают гибели опухолевых клеток тестируемых линий по механизму ферроптоза (Рисунок 48). При инкубации клеток с эрастином, жизнеспособность снижалась на 87±3% и 68±16% для клеток линии MDA-MB231 и 4Т1, соответственно. При добавлении в среду NAC – жизнеспособность клеток восстановилась до контрольных значений для 4Т1 и до 76±15% для MDA-MB231. В результате инкубации клеток линии 4T1 и MDA-MB231 в течение 40 часов с наноматериалами в обедненной среде, снижение жизнеспособности клеток не было зафиксировано. Согласно данным исследования с DCFDA, инкубация с наноматериалами в течение 40 часов не приводила к повышению продукции АФК в клетках (Рисунок 49). Таким образом, полученные наноматериалы не вызывают гибель клеток по механизму ферроптоза. Согласно результатам исследования влияния наноматериалов на клеточные линии LNCaP, PC-3, C6 и U87 в присутствии низкочастотного переменного магнитного поля была выявлена выраженная зависимость между такими параметрами, как частота и индуктивность магнитного поля, временем инкубации клеток с наночастицами и их выживаемостью. Выраженность магнито-нано-механического эффекта растет вместе с увеличением времени инкубации с 2 до 24 часов и магнитной индукции от 1 до 100 мТл (например, рисунок 50-51). По данным выживаемости клеток в магнитном поле более выраженное воздействие магнитного поля было выявлено по отношению к клеткам РС3 с наночастицами, и несколько меньшую по к клеткам LNCaP, что, предположительно, связано с менее активным накоплением наночастиц клетками линии LNCaP (Рисунок 50-55). Также следует отметить, что с увеличением времени инкубации падание выживаемости клеток LNCaP в переменном магнитном поле менее выражено по сравнению с культурой РС-3, для которой выявлено более значительное накопление от времени. Также выявлено, что клетки линии U87 демонстрируют большую восприимчивость к магнито-нано-механическому воздействию относительно С6 (Рисунок 56-61). Для всех культур клеток выявлены следующие закономерности: с увеличением амплитуды переменного низкочастотного магнитного поля выживаемость падает, также как с увеличением продолжительности инкубации наночастиц (24 часа по сравнению с 2 часами). Частотная зависимость выживаемости не столь выражена, то есть полученные данные в разных полях не имеют значительных различий. Также общим свойством является то, что наночастицы без лигандов демонстрируют более выраженный эффект по сравнению с наночастицами, на поверхности которых иммобилизованы лиганды PSMA или CREKA. В качестве примера, подтверждающего данные закономерности, построены зависимости между выживаемостью клеток и величиной магнитной индукции поля при частоте 105 Гц для культуры РС3 (Рисунок 62). По графику видно, что выживаемость клеток падает с увеличением значений воздействующего магнитного поля, когда клетки инкубированы с наночастицами без PSMA, и почти не меняется с наночастицами с PSMA. Как видно из графиков эффективность воздействия наночастиц без PSMA выше, что особенно заметно проявляется в экспериментах с величиной магнитной индукции 100 мТл. Далее приведены зависимости между частотой воздействующего магнитного поля и выживаемостью клеток при значениях величины магнитной индукции поля 100 мТл (Рисунок 63). Явные тенденции к уменьшению выживаемости клеток при увеличении частоты поля наблюдаются в случаях применения наночастиц 10 нм cPSMA при длительности инкубации 24 часа и 10 нм без PSMA с инкубацией 2 ч. Наночастицы без PSMA одинаково эффективны при любом значении частоты переменного магнитного поля, причём их эффективность максимально возможная. Таким образом, можно сделать о явной выраженности магнито-нано-механического эффекта в переменном низкочастотном магнитном поле по отношению ко всем исследованным клеточным линиям в присутствии образцов наночастиц с магнитным ядром, полученных в рамках выполняемого проекта.С увеличением времени инкубации наночастиц с клетками, ростом интенсивности интернализации наночастиц клетками, возрастанием магнитной индукции поля наблюдается уменьшение выживаемости клеток. Это, предположительно, может быть связано с эффектом броуновской релаксации магнитных наночастиц в переменном низкочастотном магнитном поле, приводящем к механической деструкции клеточных везикул, в которых находятся поглощенные клетками наночастицы….
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Адресные наногибридные материалы для терапии и диагностики онкологических патологий
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".