Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколенияНИР

Structural and functional analysis of proteins, nucleic acids and protein-nucleic acid complexes as the basis for creating synthetic regulators of gene expression and drugs of new generation

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа: По результатам исследований, проведенных в 2021 году можно заключить следующее: а) продемонстрирована роль белка hTERP в модуляции сигнальных путей, регулирующих аутофагию, биосинтез белков и пролиферацию клеток. Присутствие hTERP важно для переключения метаболизма, связанного с ускоренным делением клеток при здоровых и патологических процессах. Необходимо продолжить изучение механизмов переключения метаболизма клеток, и связанное с этим изменение экспрессии гена теломеразной РНК человека. б) При помощи двойной репортерной системы pDualrep2 проведен высокопроизводительный анализ потенциальных антибиотиков с одновременным определением активности и определением механизма действия, найдены продуценты ингибиторов синтеза белка, в том числе стрептомицина, кирромицина и амицетина. Амицетин ранее был слабо изучен, и нами показано, что он вызывает индукцию репортерного сигнала системы pDualrep2, в отличие от близкого по структуре антибиотика бластицидина С, что говорит о разном механизме действия этих антибиотиков. Дальнейшее исследование механизма действия, а также структуры сайтов связывания позволит изучить механизм действия амицетина в деталях. в) Нокаут любой из субъединиц или ингибирование каталитической активности ДНК-протеинкиназы (ДНК-ПК) существенно снижали инфекционность сконструированного псевдовируса на основе ВИЧ-1 с нативной, но не мутантной интегразой (ИН). Установлено, что уровень постинтеграционной репарации ДНК резко снижается в случае псевдовируса с мутантной ИН, а в случае вирус дикого типа - при отсутствии компонентов ДНК-ПК или ее ингибирования. Обнаружено, что ИН за счет связывания с Ku70 рекрутирует ДНК-ПK в сайт постинтеграционной репарации. г) Показано, что белки MutS и MutL E. coli эффективно взаимодействуют с внутримолекулярными G4 в различных структурных, в том числе с промотором гена обратной транскриптазы теломеразы человека. Обнаружено, что G4 стимулирует АТФазную активность MutS, но не активирует гидролиз ДНК эндонуклеазой MutH в присутствии белков MutS и MutL, а также не влияет на инициацию репарации G/T-«мисматча». Выявлено, что эффективность комплексообразования MutS с 17-звенными модифицированными дуплексами в 2–4 раза выше, чем c немодифицированной ДНК с G/T-«мисматчем». д) Исследована возможность реактивации с помощью CBL0137 генов- супрессоров опухолей, «молчащих» в клетках рака молочной железы. Экспрессия всех исследованных генов увеличивалась при инкубации клеток с CBL0137. Это открывает возможность использования кураксина CBL0137 для лечения злокачественных заболеваний, сопряженных с нарушением активности ДНК-метилтрансфераз. е) Механизм комплексообразования тромбина с ДНК-аптамером HD1включает 2 последовательные стадии. Введение флуоресцентной метки в ДНК-олигонуклеотид изменяет константу комплексообразования более чем на порядок. Отработана сборка бивалентных аптамеров. Показано, что аффинность G-квадруплексных аптамеров к тромбину и гемагглютинину не меняется при димеризации, а нековалентный дуплексный димер к шпилечному аптамеру EGFR не меняет активность in vitro, однако проявляет повышенную активность при взаимодействии с клетками опухоли мозга. ж) Под действием рекомбинантного катепсина L Tribolium castaneum (rCathLTс) проведен гидролиз 8-,10-,26-,33-членных иммуногенных пептидов глиадинов, определены сайты гидролиза. Установлена способность мутантных форм rCathLTc гидролизовать субстраты, содержащие фрагменты иммуногенных пептидов глиадинов при значении рН 3,0, близком к физиологическому в желудке человека. Проведен поиск и идентификация пищеварительных сериновых пептидаз T. molitor, подтверждена их субстратная специфичность. Полученные результаты создают предпосылки для дальнейших исследований по поиску и структурно-функциональному анализу ферментов, способных расщеплять трудногидролизуемые биологически значимые белковые субстраты. з) Получены антигены на основе синтезированных ранее производных уридина, модифицированных БСА. Получен хроматографический носитель для аффинного выделения антител. Выделены и очищены антитела на модифицированный уридин, доказана их селективность и возможность применения в поиске метилтрансферазы KIAA1456. и) Проводятся работы по созданию модельной линии нейрональных клеток эукариот для изучения особенностей гидролиза протеасомными комплексами полиглутамин-содержащих белков с целью выявления фактора, определяющего ингибирование протеолитических систем клетки в присутствии таких белков. к) Получены и охарактеризованы два патогенных мутанта митохондриальной пирофосфатазы (РРА2). Подготовлены структурные модели для исследования влияния патогенных мутаций на свойства РРА2 человека методом симуляции молекулярной динамики.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа: В результате проведенных в 2022 году исследований были получены следующие результаты: а) оптимизирована методика поиска ингибиторов биосинтеза белка с помощью разработанной нами ранее репортёрной системы, что позволило повысить её эффективность и скорость проведения эксперимента, а также снизить себестоимость тестов. Для обнаруженного ранее антибиотика терморубина проведено исследование его способности подавлять синтез белка, механизма действия и связывание с прокариотической рибосомой. б) Методами мутагенеза выявлен сайт связывания интегразы вируса ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70, с использованием молекулярной динамики построена модель связывания интегразы с Ku70, эти данные могут быть использованы для дальнейшего поиска ингибиторов связывания интегразы с Ku70. Из базы соединений отобрано 4 соединения, способных подавлять образование комплекса интегразы с Ku70, и определена концентрация полуингибирования самого эффективного из этих соединений. в) По результатам сравнительного транскриптомного анализа штаммов исходной клеточной линии R. sphaeroides и с делецией гена 6S РНК, обнаружено снижение интенсивности поглощения света для компонентов фотосистемы R. sphaeroides в мутантном штамме по сравнению с диким типом в присутствии NaCl. Вероятно, 6S РНК влияет на количество хроматофоров R. sphaeroides при солевом стрессе. г) Проведен дизайн модифицированных ДНК-аптамеров к рецептору эпидермального фактора роста, исследовано их взаимодействие с клетками линий A431, U87, а также клетками первичных культур из хирургического материала пациентов с глиобластомой Sus/Pf2, 90, 107. Обнаружено специфическое связывание флуоресцентных ДНК-аптамеров с рецептором на поверхности клеток, которое маскировано взаимодействием аптамеров с клеточной мембраной. д) Исследовано взаимодействие фосфонистых и фосфоновых аналогов S-аденозил-L-метионина и S-аденозил-L-гомоцистеина с каталитическим доменом ДНК-метилтрансферазы мыши Dnmt3a. Показано, что фосфонистый и фосфоновый аналоги S-аденозил-L-метионина являются субстратами Dnmt3a, хотя и несколько более слабыми, чем природный S-аденозил-L-метионин. Оба фосфор-содержащих аналога S-аденозил-L-гомоцистеина проявляли близкую ингибиторную активность в отношении Dnmt3a и были примерно в четыре раза менее активными по сравнению с исходным S-аденозил-L-гомоцистеином. е) В результате геномного и транскриптомного анализа представителей насекомых семейства Tenebrionidae выявлен обширный набор сериновых пептидаз и их гомологов, принадлежащих к семейству S1 химотрипсина. ж) При изучении серии 15-звенных аптамеров к тромбину с единичной или двойной модификацией было показано, что первоочередную роль в константе диссоциации аптамеров к тромбину играет сайт модификации, а не тип модификатора. з) Осуществлен дизайн и синтез антимикробных пептидов, а также серии их аналогов. Изучены комплексы прокариотических рибосом с аналогами антимикробных пептидов расчетными и экспериментальными методами, и показано, что новые аналоги могут связываться с бактериальными рибосомами, а введение в структуру трифенилфосфониевых катионов приводит к повышению аффинности к бактериальным рибосомам. Полученные аналоги оказались способны избирательно ингибировать процесс прокариотической трансляции и подавлять штаммы бактерий, устойчивых к действию макролидов. и) Проводятся работы по разработке модели нейродегенеративных заболеваний на основе клеточной линии N2a. Получены клоны клеток, трансфицированных плазмидами, несущими ген полноразмерного нативного или мутантного хантингтина под контролем индуцибельного промотора. Для отобранных клонов показано значительное увеличение экспрессии мРНК хантингтина под действием индуктора. Для исследования влияние ингибиторов трипсиновой активности на гидролиз протеасомными комплексами полиглутамин-содержащих пептидов и белков подобраны ингибиторы, способные селективно действовать на трипсиновую активность протеасом. к) продолжена работа по характеристике митохондриальной пирофосфатазы РРА2. Обнаружены структурные и функциональные отличия Нр_РРА2 от цитоплазматического ортолога, Нр_РРА1. Существенных функциональных изменений варианта S34F Нр_РРА2 по сравнению с нативным белком не выявлено. Другой мутантный вариант, M54V Hp_PPA2, характеризуется значительным снижением активности и сродства к ионам Mg2+, что обусловлено отличием в координации магния в этом мутанте от таковой в нативном белке. Среди митохондриальных метаболитов обнаружены три потенциальных эффектора Нр_РРА2, которые будут исследованы в дальнейшем. л) Разработан метод тестирования редкой мутации А161С промотера гена TERT
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа: В результате выполнения работы на данном этапе в культуральной жидкости, продуцируемой одним из штаммов рода Streptomyces sp., был обнаружен антибиотик фактумуцин, обладающий интересными свойствами. Показано, что синтезированные ранее конъюгаты олигопептидов с алкил(трифенил)фосфониевыми группировками избирательно действуют на трансляцию прокариот. Также был предложен новый класс ингибиторов репликации ВИЧ-1 и проведены исследования взаимосвязи структуры и функции этих ингибиторов. Впервые выполнен сравнительный траскриптомный анализ R. sphaeroides 2.4.1 штаммов дикого типа и с делецией гена 6S РНК. Установлено, что при удалении гена 6S РНК достоверно изменяется уровень транскрипции 9 генов, которые вовлечены в важные жизненные процессы R. sphaeroides. Продемонстрировано замедление роста штамма с делецией гена 6S РНК по сравнению со штаммом дикого типа R. sphaeroides в клетках, растущих в микроаэробных условиях в присутствии 0,25 М NaCl или 0,25 М KCl. Впервые обнаружено снижение максимумов поглощения основных компонентов хроматофоров бактерии в спектрах клеточных культур штамма с делецией гена 6S РНК по сравнению со штаммом дикого типа R. sphaeroides в условиях солевого стресса, что может быть связано с понижением эффективности транскрипции генов pufB, pufL, pufX, puc2B, ответственных за синтез основных компонентов фотосистемы. Получены аптамерные ДНК, селективно взаимодействующие с онкомаркерными белками EGFR или CD133, что позволяет детектировать раковые клетки в клинических образцах глиобластом. Обнаружено, что олигонуклеотид, имитирующий промотор онкогена c-MYC, ингибирует ДНК-метилтрансферазу Dnmt3a, на основании этого предположен механизм активации транскрипции c-MYC. Выявлены особенности, позволяющие модулировать аффинность аптамеров, содержащих модифицированные тимины, к тромбину. В результате биоинформатического анализа оценены уровни экспрессии генов собранных последовательностей сериновых пептидаз семейства S1 и их гомологов у T. molitor. Выбраны белки для получения в форме рекомбинантных препаратов, и начаты эксперименты по их наработке для дальнейших исследований. Получены стабильно трансфицированные клеточные линии Neuro2a, несущие ген нативного либо мутантного хантингтина человека, эти линии частично охарактеризованы. Сделаны предположения, каким образом замена Met52Val может влиять на связывание активаторных ионов магния митохондриальной пирофосфатазой РРА2 O. рarapolymorpha.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа: Обнаружен антибиотик пикромицин, способный подавлять трансляцию. Осуществлен дизайн и синтез серии аналогов пролин-аргининового антимикробного пептида бактенецина 7, обладающих антибактериальной активностью. Изучено новое соединение MMV180, способное ингибировать взаимодействие интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70. Показано, что данное соединение не влияет на основную клеточную функцию Ku70. Исследована серия анти-CD133 ДНК-аптамеров, которые были использованы для аптатераностики культур клеток пациентов с глиобластомой, в том числе для рецептор-зависимой целевой доставки терапевтического цитотоксического агента доксорубицина в клетки. Показана детекция CD133-позитивных прогениторных клеток опухоли с помощью аптамеров и их конструкций. Анти-CD133 ДНК-аптамеры и нековалентные аптамерные конструкции с комплементарными олигонуклеотидами (АККО) эффективно использованы для разработки аптатераностики глиобластомы, что востребовано в рамках консорциума в совместных работах с университетом Сеченова, ИВНД и НФ РАН, НМИЦ им. Бурденко. Изучены свойства модифицированных аптамеров к тромбину, определены модификации, влияющие на аффинность. Проанализирована цитотоксичность и избирательность действия к опухолевым клеткам нескольких групп химических соединений, в том числе гидантоиновых производных, для которых показана довольно высокая токсичность при отсутствии избирательности. Дальнейшее исследование этих групп производных прекращено. В процессе изучения функции 6S РНК в клетке установлено, что при удалении гена 6S РНК достоверно изменяется уровень транскрипции 9 генов, которые вовлечены в важные жизненные процессы С. sphaeroides. Обнаружено, что белки DksA и GreB практически полностью блокируют высвобождение РНК-полимеразы E. coli из комплекса с 6S РНК E. coli в присутствии нуклеозидтрифосфатов. При исследовании функционирования метилтрансферазы Dnmt3a установлено, что формирование G-квадруплексов в промоторе гена MGMT можно рассматривать как одну из причин гипометилирования ДНК в этой области вследствие секвестирования фермента на неканонической структуре. При выполнении работ по изучению гомологов сериновых пептидаз насекомых охарактеризованы рекомбинантные препараты активной пептидазы SerP38 с неканонической структурой субстрат-связывающего сайта и гомолога SerPH122, показано, что SerP38 способна гидролизовать только субстраты химотрипсина, в отличие от пептидаз ракообразных. Проанализированы данные научной литературы по патологическим внутриклеточным механизмам, характерным для хореи Хантингтона и описывающих роль белка хантингтина в этих процессах. Показано, что рекомбинантный вариант белка NEP вируса гриппа А способен формировать сферические агрегаты различной морфологии, предложен гипотетический комплексный механизм формирования амилоидных фибрилл, обсуждена биологическая значимость этих агрегатов. При изучении свойств митохондриальной пирофосфатазы методом молекулярной динамики мутантного варианта выявлены структурные основы снижения активности, и методом докинга найдены три типа предполагаемых центров связывания эффекторов.
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа:
6 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа:
7 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа:
8 1 января 2028 г.-31 декабря 2028 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".