Полифункциональные ферментные биопрепараты для разложения фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и лактонсодержащих индукторов развития устойчивых популяций бактерий, провоцирующих развитие заболеваний животных и растений в условиях сельскохозяйственного производстваНИР

Multifunctional enzymatic biological preparations for decomposition of organophosphorus pesticides, mycotoxins and lactone-containing inducers forming resistant bacterial populations those cause diseases in animals and plants under conditions of agricultural production

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Полифункциональные ферментные биопрепараты для разложения фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и лактонсодержащих индукторов развития устойчивых популяций бактерий, провоцирующих развитие заболеваний животных и растений в условиях сельскохозяйственного производства
Результаты этапа: 1. Наработана генетически-модифицированная ОРН, содержащая гексагистидиновую последовательность на N-конце молекулы белка (His6-OPH), для последующего проведения работ по созданию стабилизированной формы фермента и введения его в биопрепараты разного предназначения. Разработаны и исследованы основные характеристики образцов стабилизированных форм фермента His6-OPH в виде наноразмерных частиц, представляющих собой нековалентные фермент-полиэлектролитные комплексы, сформированные His6-OPH и полимерным полианионом; оптимизированы условия их получения (проведено варьирование температуры, рН, ионной силы, химической природы полиэлектролитов; молярных соотношений белка и полианиона в составе полиэлектролитного комплекса и т.д.) с целью сохранения максимальной каталитической активности полученных форм по трём основным классам субстратов (различным фосфорорганическим пестицидам, микотоксинам и N-ацилгомосеринлактонам) и стабильности (операционной и при хранении); проведена оценка уровня стабилизации фермента и эффективности каталитического действия. 2. Разработаны биопрепараты на основе стабилизированных форм His6-OPH, иммобилизованных (для удобства применения и получения дополнительного стабилизационного эффекта для фермента в реальных средах с токсикантами) на различных дешёвых, экологичных носителях и отходах промышленности и сельского хозяйства (цеолитах, бумаге, яичной скорлупе) с целью детоксификации фосфорорганических соединений в почвах. Определены основные каталитические характеристики полученных образцов в почвогрунтах с разными агрохимическими характеристиками (величиной рН, содержанием гуминовых веществ, влажностью и т.д.). 3. Разработаны и исследованы каталитические характеристики биопрепаратов на основе His6- OPH для детоксификации фосфорорганических соединений в сельскохозяйственном сырье и кормах. Установлено влияние состава биопрепаратов (концентрации активного фермента, тип носителя) на эффективность гидролиза пестицидов в разных субстратах. 4. Разработаны биопрепараты на основе стабилизированных форм His6-OPH, иммобилизованных (для удобства применения и получения дополнительного вклада в удаление токсинов) на различных дешёвых, экологичных сорбентах, в том числе полученных в результате плазменной модификации с целью удаления микотоксинов из разных видов сырья и типов кормов для животных. Определены основные каталитические характеристики полученных образцов в исследуемых субстратах, установлена субстратная специфичность действия биопрепаратов в отношении разных микотоксинов и установлены оптимальные условия и продолжительность функционирования подобных биопрепаратов. 5. Исследованы возможности проведения одновременной детоксификации микотоксинов и фосфорорганических соединений в составе различного сельскохозяйственного сырья и кормов. Определены эффективности таких процессов в отношении каждого из токсинов при варьировании их концентрации, дозы и типа применяемого биопрепарата из числа разработанных, разработан способ проведения таких процессов с учетом оптимизированных условий применения биопрепаратов на предыдущих стадиях исследований. 6. Определены каталитические характеристики биопрепаратов, разработанных на основе His6- OPH с лактоназной активностью, в реакциях гидролиза широкого спектра N-ацилгомосерин лактонов и оптимизированы условия проведения этих реакций. Исследована бактериостатическая активность биопрепаратов на основе His6-OPH в отношении высококонцентрированных популяций различных грамотрицательных бактерий при комбинированном применении ферментных биопрепаратов с антимикробными агентами (антибиотиками и поверхностно-активными веществами). Определено влияние последних на активность самого фермента в составе биопрепаратов.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Полифункциональные ферментные биопрепараты для разложения фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и лактонсодержащих индукторов развития устойчивых популяций бактерий, провоцирующих развитие заболеваний животных и растений в условиях сельскохозяйственного производства
Результаты этапа: 1. Определены наилучшие условия для эффективной деградации фосфорорганических пестицидов (ФОП) под действием разработанных ферментных препаратов. Установлено, что Хлорпирифос (в виде препарата Дурсбан) в концентрации 100 мг/кг почвы и другие ФОП (параоксон, паратион, метил-паратион, кумафос) могут быть гидролизованы на 100% за 48-72 ч. Для этого предварительно нужно сдвинуть рН почвы в слабощелочную область (рН 7,5-8,5), при этом лучшим вспомогательным компонентом является Ca(OH)2. Далее необходимо увлажнить почву до 60-80% и поддерживать этот уровень влажности в ходе ферментативной обработки почвы, а для этого в почву следует внести ферментный препарат. Применение того же способа детоксификации ФОП в случае песчаной, каштановой, серой лесной почвы и чернозема позволило достичь 49-92%-ой деструкции 100 мг/кг хлорпирифоса уже в течение первых суток. Полное разложение пестицида во всех вариантах достигалось за 72 ч. При этом отсутствовала экотоксичность (по анализу остаточной биолюминесценции клеток фотобактерий) в таких образцах почвы после ферментативной обработки. 2. При разработке и оптимизации способов очистки сельхозсырья ферментными препаратами от остатков ФОП (25-275 мг/кг) показано, что для 100% очистки сырья наиболее эффективным представляется использование ферментполиэлектролитных комплексов (ФПК) на основе His6-OPH и полиаминокислот (полиаспарагиновой, ПАК или полиглутаминовой, ПГК) в дозировке 1000 Ед/кг сырья, время обработки – 24-30 ч (в зависимости от пестицида, содержащегося в сырье), рабочий температурный диапазон от +17ºС, рекомендуется измельчение и тщательная гомогенизация реакционной среды в герметичной емкости. Для очистки корма для животных, которым в рационе рекомендованы минеральные пищевые добавки (крупный рогатый скот, птица и др.), целесообразным является использование ФПК, иммобилизованных на плазмомодифицированных натуральных цеолитах. Испытания in vivo показали, что несмотря на отсутствие клинических признаков интоксикации хлорпирифосом у контрольных и опытных животных (крыс), питавшихся в течение 1 месяца зерносмесью, контаминированной данным пестицидом, в контрольной группе наблюдались изменения биохимических показателей крови крыс. В то же время показатели крови животных интактной группы и опытных животных, потреблявших очищенную зерносмесь, соответствовали стандартным значениям. Обработка в течение 24 ч кормовой зерносмеси, контаминированной исходно 48 мг/кг хлопририфоса, ферментным препаратом His6-OPH/ПГК50 в дозе 1000 Ед/кг смеси оказалась эффективной и позволила удержать исследованные биохимические показатели крови модельных животных (крыс) в пределах нормы. 3. впервые исследован и предложен гипотетический механизм гидролиза патулина, зеараленона и доксиниваленола под действием His6-OPH. Для этого использовали метод молекулярного докинга, ранее успешно себя зарекомендовавший при биоинженерии фермент-полиэлектролитных комплексов, а также Фурье-ИК-спектрометрию. Определено раскрытие лактонных циклов в патулине и зеараленоне, а также деэпоксидация деоксиниваленола, что не противоречит известному механизму действия His6-OPH. Исследован ферментативный гидролиз микотоксинов в пшеничной соломе, свекловичном жоме и зерне пшеницы. Механофизическая предобработка сырья оказывала ограниченное положительное влияние на процесс, а вот рН реакционной среды наряду с вносимой дозой His6-OPH значительно влияли на эффективность ферментативной деградации микотоксинов. Показано, что рН среды, максимально приближенный к рН-оптимуму действия His6-OPH (рН 10,5), позволяет вводить в реакционную среду менее 200 ед на 100 мкг субстрата и в течение 1 ч обеспечивать 90%-ную конверсии субстратов. Исчерпывающий гидролиз возможен за счёт: увеличения длительности обработки, увеличения дозы His6-OPH (менее рационально), введения дополнительных компонентов среды. В качестве таковых предпочтительными представляются сорбенты, в частности, силикагели, обработанные низкотемпературной плазмой и фракционированные по размерам частиц. Так, введение 1 масс.% такой добавки позволяет дополнительно снизить остаточную концентрацию микотоксинов (вплоть до 1,5 раз от уровня в их отсутствие). Независимо от наличия или отсутствия силикагелей за счёт ферментативного гидролиза удалось элиминировать экотоксичность (определяли по биолюминесценции фотобактерий) образцов зерна, контаминированных патулином, зеараленоном и доксиниваленолом. 4. Оптимизированы условия комбинированного применения антимикробных средств с наиболее эффективными по своему действию биопрепаратами на основе His6-OPH против устойчивых ассоциаций различных грамотрицательных бактерий. Разработан эффективный способ обработки различных устойчивых бактериальных популяций ждя регилирования из численности. 5. Продемонстрирован практический потенциал разработанных биопрепаратов in situ и in vivo в отношении реальных объектов Продемонстрирована принципиальная возможность использования комбинации His6-OPH/ПГК50, проявляющей лактоназную активность, с Фитолавином для элиминирования развития бактериального поражения побегов томатов, вызываемого бактериальными клетками Xanthomonas campestris. Такая комбинация позволяет снизить в 2 раза концентрации антибактериального компонента с сохранением эффективности его действия. Дважды по 6 дней (в экспериментальном периоде - 3 месяца) в рацион птиц и кроликов с питьевой водой вводился комбинированный препарат. В ходе экспериментов дозировка Колистина-40 составляла в 2 раза ниже рекомендуемой производителем. Для профилактики бактериальных инфекций ежедневно в течение 3 месяцев в рацион кур добавляли ФПК, иммобилизованные на плазмамодифицированном цеолите. Дозировка цеолитов (фракция - до 1,5 мм) в среднем составляла 2±0,5 г/1 животное в сутки (около 500±50 Ед активности). Для профилактики бактериальных инфекций ежедневно в течение 3 месяцев в рацион кроликов на гранулы комбикорма Прокорм насыпалась и перемешивалась с кормом навеска препарата на основе His6-OPH/ПГК50, чтобы суточное потребление препарата составило 500±50 Ед на 1 особь. Исследования на курах и кроликах, проведённые на базе частного фермерского хозяйства в п.Свободный Серп в Тульской в режиме профилактики бактериального заражения, не выявили каких-либо противопоказаний или осложнений от вводимого ФПК в комбинации с Колистином-40. 6. Для апробации in situ детоксификации ФОП в сельскохозяйственных кормах и продукции под действием биопрепаратов на основе His6-OPH были выбраны посевы сахарной свеклы, которые обрабатывались Пиринексом (содержание хлорпирифоса 480 г/л) дважды с июня по август 2017 года в период вегетации растений в дозировке 1,5 л/га (720 г хлорпирифоса/га). Исходно в составе корнеплодов остаточное содержание хлорпирифоса 0,03±0,001 мг/кг (максимально допустимый уровень (МДУ) Евросоюз и ФАО ВОЗ - 0,05 мг/кг, РФ - 0,005 мг/кг). Корнеплоды помещались на 1 ч в раствор, содержащий His6-OPH/ПГК50, из расчета 1000 Ед/кг свеклы. После этого остаточное содержание хлорпирифоса в сырье не превышало МДУ и составляло 0,004±0,0002 мг/кг. Таким образом, с положительным результатом была апробирована возможность in situ детоксификации ФОП в сельскохозяйственной продукции под действием биопрепаратов на основе His6-OPH.
3 23 апреля 2019 г.-31 декабря 2019 г. Полифункциональные ферментные биопрепараты для разложения фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и лактонсодержащих индукторов развития устойчивых популяций бактерий, провоцирующих развитие заболеваний животных и растений в условиях сельскохозяйственного производства
Результаты этапа: 1. Отобраны ферменты, способные деградировать различные по химическому строению микотоксины, и исследована возможность их совместного применения в комбинированных ферментных препаратах, осуществляющих детоксификацию разных микотоксинов. 2. Разработаны стабилизированные формы комбинированных ферментных препаратов и исследованы их каталитические характеристики в процессах деградации одновременно нескольких микотоксинов, способных присутствовать в сельскохозяйственном сырье и продуктах. 3. Разработаны комбинированные ферментные препараты на основе His6-OPH и других ферментов, гидролизующих АГЛ, с целью улучшения эффективности действия и расширения субстратной специфичности в отношении широкого круга грамотрицательных бактерий. 4. Разработаны комбинированные ферментные препараты на основе His6-OPH и пептидаз, гидролизующих пептиды-индукторы, с целью получения двойной активности (против грамположительных и грамотрицательных бактерий). 5. Исследована возможность введения дополнительных добавок в комбинированные ферментные препараты, деградирующие микотоксины.
4 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Полифункциональные ферментные биопрепараты для разложения фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и лактонсодержащих индукторов развития устойчивых популяций бактерий, провоцирующих развитие заболеваний животных и растений в условиях сельскохозяйственного производства
Результаты этапа: 1. Протестированы разработанные комбинированные препараты, деградирующие одновременно несколько микотоксинов, на клеточных линиях животных и человека in vitro. Определена эко- и цитотоксичность самих комбинированных препаратов, а также продуктов деградации микотоксинов, полученных в результате их действия, с использованием общепринятых стандартных тест-систем in vitro. 2. Разработаны комбинированные ферментные препараты на основе His6-OPH и миметиков пептидов, имитирующих индукторы грамположительных бактерий, с целью получения двойного действия (против грамположительных и грамотрицательных бактерий). Молекулярно смоделированы, получены и исследованы стабилизированные формы таких ферментных препаратов. Определена эффективность действия полученных препаратов (в комбинации с обычными антибиотиками и без них) в отношении различных грамположительных и грамотрицательных бактерий. 3. Исследовано влияние дополнительных добавок на эффективность действия комбинированных ферментных препаратов против грамположительных и грамотрицательных бактерий. 4. Проведены лабораторные испытания разработанных комбинированных препаратов, деградирующих одновременно несколько микотоксинов, на животных моделях. Будут разработаны наиболее эффективные способы и режимы введения полученных препаратов. 5. Протестирована эко- и цитотоксичность комбинированных ферментных препаратов против грамположительных и грамотрицательных бактерий с использованием общепринятых стандартных тест-систем in vitro. Оценена эффективность действия полученных препаратов в отношении различных популяций грамположительных и грамотрицательных патогенных бактерий in vivo. Разработаны наиболее эффективные способы и режимы введения полученных биокатализаторов в живые объекты. 6. Полученные результаты подготовлены к публикации и патентованию.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".