ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Проект ориентирован на решение ключевой проблемы, связанной с разработкой научных основ получения и применения высокоактивных и стабильных ферментсодержащих биопрепаратов, позволяющих повысить эффективность сельскохозяйственного производства за счет высокоспецифичного гидролиза фосфорорганических пестицидов и микотоксинов в сельскохозяйственном сырье и кормах для животных, а также разлагающих вещества, являющиеся индукторами формирования устойчивых высококонцентрированных популяций бактерий, патогенных для растений и животных
The goal of the project is a development of new enzyme biological preparations to improve an efficiency of the agriculture and to increase food safety of Russian peoples. Such biological preparations are based on application of enzyme His6-OPH stabilized in the non-covalent enzyme-polyelectrolyte complexes of His6-OPH and polyanions and are intended to eliminate organophosphorus toxicants and mycotoxins from various objects of agricultural production (soil, raw materials, animal feed and other products) and to break-up resistant microbial populations of Gram-negative bacteria. So, organophosphorus pesticides make up nearly 40% of all the pesticides used in agriculture (crop and livestock). Various plants (cereals, melons, citrus fruits, etc.) and animals are treated with them not only during their growth, but also in manufacturing finished products with the purpose of their long-term preservation (crop of vegetables, fruits, cereals, hides, wools and others). Therefore, there is a threat of using these dangerous neurotoxicants by man even with processed products. While all organophosphorus compounds also have a cumulative effect, i.e. the toxicity increases and is manifested over time with the accumulation of these substances in both the human body and the animals themselves.
Будут разработаны новые биопрепараты на основе стабилизированных форм фермента His6-OPH в виде наноразмерных частиц, представляющих собой нековалентные фермент- полиэлектролитные комплексы, сформированные His6-OPH и полимерным полианионом, и их основные характеристики будут исследованы при детоксификации трех основных классов субстратов (различных фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и N- ацилгомосеринлактонов) в различных сельскохозяйственных объектах (сырье, кормах животных и т.д.). Будут разработаны биопрепараты на основе стабилизированных форм His6-OPH, иммобилизованной (для простоты использования и получения дополнительного стабилизационного эффекта для фермента в реальных средах с токсикантами) на различных дешёвых, экологичных носителях и отходах промышленности и сельского хозяйства с целью детоксификации фосфорорганических соединений в почвах, и их основные характеристики будут определены в исследуемых почвогрунтах с разными агрохимическими характеристиками. Также биопрепараты на основе His6-OPH будут комбинированы с различными сорбентами, в том числе полученными плазменной модификацией, для удаления микотоксинов из различного сельскохозяйственного сырья и кормов животных. Будет исследована возможность одновременной детоксификации микотоксинов и фосфорорганических соединений в различном сельскохозяйственном сырье и кормах животных, и условия процесса будут оптимизированы и протестированы на сельскохозяйственных животных. Будут определены каталитические характеристики биопрепаратов на основе His6-OPH с лактоназной активностью в ходе гидролиза широкого круга N-ацилгомосеринлактонов, и условия этих реакций буду оптимизированы. Бактериостатическая активность биопрепаратов на основе His6-OPH будет исследована по отношению высококонцентрированных популяций грамотрицательных бактерий с комбинированным использованием ферментных биопрепаратов и антимикробных агентов (антибиотиков и поверхностно-активных веществ). В результате будут разработаны и апробированы методы наиболее эффективного применения биопрепаратов на основе стабилизированных форм His6-OPH, предназначенных для гидролитической деградации фосфорорганических соединений, микотоксинов и устойчивых бактериальных ассоциаций (посредством гидролиза N-ацилгомосеринлактонов) в реальных средах.
Разработаны способы (условия и последовательности операций) наиболее эффективного применения биопрепаратов на основе стабилизированных форм His6-OPH для гидролитической деструкции фосфорорганических пестицидов и микотоксинов, определены целесообразность и способы подготовки объектов к внесению биопрепаратов, остаточная экотоксичность образцов через 6-72 ч после их биообработки равна нулевому значению. Предложенная стратегия ферментативной очистки почв, сельскохозяйственной продукции и кормов от пестицидов и микотоксинов является перспективной для реализации не только в РФ, но и за рубежом. Потенциальный рынок сбыта ферментных биопрепаратов, как и рынок сбыта пестицидов, достаточно широкий и охватывает такие страны, как Египет, Индия, Китай, Малайзия, Пакистан, Палестина, Израиль, страны СНГ, Турция и многие другие.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Полифункциональные ферментные биопрепараты для разложения фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и лактонсодержащих индукторов развития устойчивых популяций бактерий, провоцирующих развитие заболеваний животных и растений в условиях сельскохозяйственного производства |
Результаты этапа: 1. Наработана генетически-модифицированная ОРН, содержащая гексагистидиновую последовательность на N-конце молекулы белка (His6-OPH), для последующего проведения работ по созданию стабилизированной формы фермента и введения его в биопрепараты разного предназначения. Разработаны и исследованы основные характеристики образцов стабилизированных форм фермента His6-OPH в виде наноразмерных частиц, представляющих собой нековалентные фермент-полиэлектролитные комплексы, сформированные His6-OPH и полимерным полианионом; оптимизированы условия их получения (проведено варьирование температуры, рН, ионной силы, химической природы полиэлектролитов; молярных соотношений белка и полианиона в составе полиэлектролитного комплекса и т.д.) с целью сохранения максимальной каталитической активности полученных форм по трём основным классам субстратов (различным фосфорорганическим пестицидам, микотоксинам и N-ацилгомосеринлактонам) и стабильности (операционной и при хранении); проведена оценка уровня стабилизации фермента и эффективности каталитического действия. 2. Разработаны биопрепараты на основе стабилизированных форм His6-OPH, иммобилизованных (для удобства применения и получения дополнительного стабилизационного эффекта для фермента в реальных средах с токсикантами) на различных дешёвых, экологичных носителях и отходах промышленности и сельского хозяйства (цеолитах, бумаге, яичной скорлупе) с целью детоксификации фосфорорганических соединений в почвах. Определены основные каталитические характеристики полученных образцов в почвогрунтах с разными агрохимическими характеристиками (величиной рН, содержанием гуминовых веществ, влажностью и т.д.). 3. Разработаны и исследованы каталитические характеристики биопрепаратов на основе His6- OPH для детоксификации фосфорорганических соединений в сельскохозяйственном сырье и кормах. Установлено влияние состава биопрепаратов (концентрации активного фермента, тип носителя) на эффективность гидролиза пестицидов в разных субстратах. 4. Разработаны биопрепараты на основе стабилизированных форм His6-OPH, иммобилизованных (для удобства применения и получения дополнительного вклада в удаление токсинов) на различных дешёвых, экологичных сорбентах, в том числе полученных в результате плазменной модификации с целью удаления микотоксинов из разных видов сырья и типов кормов для животных. Определены основные каталитические характеристики полученных образцов в исследуемых субстратах, установлена субстратная специфичность действия биопрепаратов в отношении разных микотоксинов и установлены оптимальные условия и продолжительность функционирования подобных биопрепаратов. 5. Исследованы возможности проведения одновременной детоксификации микотоксинов и фосфорорганических соединений в составе различного сельскохозяйственного сырья и кормов. Определены эффективности таких процессов в отношении каждого из токсинов при варьировании их концентрации, дозы и типа применяемого биопрепарата из числа разработанных, разработан способ проведения таких процессов с учетом оптимизированных условий применения биопрепаратов на предыдущих стадиях исследований. 6. Определены каталитические характеристики биопрепаратов, разработанных на основе His6- OPH с лактоназной активностью, в реакциях гидролиза широкого спектра N-ацилгомосерин лактонов и оптимизированы условия проведения этих реакций. Исследована бактериостатическая активность биопрепаратов на основе His6-OPH в отношении высококонцентрированных популяций различных грамотрицательных бактерий при комбинированном применении ферментных биопрепаратов с антимикробными агентами (антибиотиками и поверхностно-активными веществами). Определено влияние последних на активность самого фермента в составе биопрепаратов. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Полифункциональные ферментные биопрепараты для разложения фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и лактонсодержащих индукторов развития устойчивых популяций бактерий, провоцирующих развитие заболеваний животных и растений в условиях сельскохозяйственного производства |
Результаты этапа: 1. Определены наилучшие условия для эффективной деградации фосфорорганических пестицидов (ФОП) под действием разработанных ферментных препаратов. Установлено, что Хлорпирифос (в виде препарата Дурсбан) в концентрации 100 мг/кг почвы и другие ФОП (параоксон, паратион, метил-паратион, кумафос) могут быть гидролизованы на 100% за 48-72 ч. Для этого предварительно нужно сдвинуть рН почвы в слабощелочную область (рН 7,5-8,5), при этом лучшим вспомогательным компонентом является Ca(OH)2. Далее необходимо увлажнить почву до 60-80% и поддерживать этот уровень влажности в ходе ферментативной обработки почвы, а для этого в почву следует внести ферментный препарат. Применение того же способа детоксификации ФОП в случае песчаной, каштановой, серой лесной почвы и чернозема позволило достичь 49-92%-ой деструкции 100 мг/кг хлорпирифоса уже в течение первых суток. Полное разложение пестицида во всех вариантах достигалось за 72 ч. При этом отсутствовала экотоксичность (по анализу остаточной биолюминесценции клеток фотобактерий) в таких образцах почвы после ферментативной обработки. 2. При разработке и оптимизации способов очистки сельхозсырья ферментными препаратами от остатков ФОП (25-275 мг/кг) показано, что для 100% очистки сырья наиболее эффективным представляется использование ферментполиэлектролитных комплексов (ФПК) на основе His6-OPH и полиаминокислот (полиаспарагиновой, ПАК или полиглутаминовой, ПГК) в дозировке 1000 Ед/кг сырья, время обработки – 24-30 ч (в зависимости от пестицида, содержащегося в сырье), рабочий температурный диапазон от +17ºС, рекомендуется измельчение и тщательная гомогенизация реакционной среды в герметичной емкости. Для очистки корма для животных, которым в рационе рекомендованы минеральные пищевые добавки (крупный рогатый скот, птица и др.), целесообразным является использование ФПК, иммобилизованных на плазмомодифицированных натуральных цеолитах. Испытания in vivo показали, что несмотря на отсутствие клинических признаков интоксикации хлорпирифосом у контрольных и опытных животных (крыс), питавшихся в течение 1 месяца зерносмесью, контаминированной данным пестицидом, в контрольной группе наблюдались изменения биохимических показателей крови крыс. В то же время показатели крови животных интактной группы и опытных животных, потреблявших очищенную зерносмесь, соответствовали стандартным значениям. Обработка в течение 24 ч кормовой зерносмеси, контаминированной исходно 48 мг/кг хлопририфоса, ферментным препаратом His6-OPH/ПГК50 в дозе 1000 Ед/кг смеси оказалась эффективной и позволила удержать исследованные биохимические показатели крови модельных животных (крыс) в пределах нормы. 3. впервые исследован и предложен гипотетический механизм гидролиза патулина, зеараленона и доксиниваленола под действием His6-OPH. Для этого использовали метод молекулярного докинга, ранее успешно себя зарекомендовавший при биоинженерии фермент-полиэлектролитных комплексов, а также Фурье-ИК-спектрометрию. Определено раскрытие лактонных циклов в патулине и зеараленоне, а также деэпоксидация деоксиниваленола, что не противоречит известному механизму действия His6-OPH. Исследован ферментативный гидролиз микотоксинов в пшеничной соломе, свекловичном жоме и зерне пшеницы. Механофизическая предобработка сырья оказывала ограниченное положительное влияние на процесс, а вот рН реакционной среды наряду с вносимой дозой His6-OPH значительно влияли на эффективность ферментативной деградации микотоксинов. Показано, что рН среды, максимально приближенный к рН-оптимуму действия His6-OPH (рН 10,5), позволяет вводить в реакционную среду менее 200 ед на 100 мкг субстрата и в течение 1 ч обеспечивать 90%-ную конверсии субстратов. Исчерпывающий гидролиз возможен за счёт: увеличения длительности обработки, увеличения дозы His6-OPH (менее рационально), введения дополнительных компонентов среды. В качестве таковых предпочтительными представляются сорбенты, в частности, силикагели, обработанные низкотемпературной плазмой и фракционированные по размерам частиц. Так, введение 1 масс.% такой добавки позволяет дополнительно снизить остаточную концентрацию микотоксинов (вплоть до 1,5 раз от уровня в их отсутствие). Независимо от наличия или отсутствия силикагелей за счёт ферментативного гидролиза удалось элиминировать экотоксичность (определяли по биолюминесценции фотобактерий) образцов зерна, контаминированных патулином, зеараленоном и доксиниваленолом. 4. Оптимизированы условия комбинированного применения антимикробных средств с наиболее эффективными по своему действию биопрепаратами на основе His6-OPH против устойчивых ассоциаций различных грамотрицательных бактерий. Разработан эффективный способ обработки различных устойчивых бактериальных популяций ждя регилирования из численности. 5. Продемонстрирован практический потенциал разработанных биопрепаратов in situ и in vivo в отношении реальных объектов Продемонстрирована принципиальная возможность использования комбинации His6-OPH/ПГК50, проявляющей лактоназную активность, с Фитолавином для элиминирования развития бактериального поражения побегов томатов, вызываемого бактериальными клетками Xanthomonas campestris. Такая комбинация позволяет снизить в 2 раза концентрации антибактериального компонента с сохранением эффективности его действия. Дважды по 6 дней (в экспериментальном периоде - 3 месяца) в рацион птиц и кроликов с питьевой водой вводился комбинированный препарат. В ходе экспериментов дозировка Колистина-40 составляла в 2 раза ниже рекомендуемой производителем. Для профилактики бактериальных инфекций ежедневно в течение 3 месяцев в рацион кур добавляли ФПК, иммобилизованные на плазмамодифицированном цеолите. Дозировка цеолитов (фракция - до 1,5 мм) в среднем составляла 2±0,5 г/1 животное в сутки (около 500±50 Ед активности). Для профилактики бактериальных инфекций ежедневно в течение 3 месяцев в рацион кроликов на гранулы комбикорма Прокорм насыпалась и перемешивалась с кормом навеска препарата на основе His6-OPH/ПГК50, чтобы суточное потребление препарата составило 500±50 Ед на 1 особь. Исследования на курах и кроликах, проведённые на базе частного фермерского хозяйства в п.Свободный Серп в Тульской в режиме профилактики бактериального заражения, не выявили каких-либо противопоказаний или осложнений от вводимого ФПК в комбинации с Колистином-40. 6. Для апробации in situ детоксификации ФОП в сельскохозяйственных кормах и продукции под действием биопрепаратов на основе His6-OPH были выбраны посевы сахарной свеклы, которые обрабатывались Пиринексом (содержание хлорпирифоса 480 г/л) дважды с июня по август 2017 года в период вегетации растений в дозировке 1,5 л/га (720 г хлорпирифоса/га). Исходно в составе корнеплодов остаточное содержание хлорпирифоса 0,03±0,001 мг/кг (максимально допустимый уровень (МДУ) Евросоюз и ФАО ВОЗ - 0,05 мг/кг, РФ - 0,005 мг/кг). Корнеплоды помещались на 1 ч в раствор, содержащий His6-OPH/ПГК50, из расчета 1000 Ед/кг свеклы. После этого остаточное содержание хлорпирифоса в сырье не превышало МДУ и составляло 0,004±0,0002 мг/кг. Таким образом, с положительным результатом была апробирована возможность in situ детоксификации ФОП в сельскохозяйственной продукции под действием биопрепаратов на основе His6-OPH. | ||
3 | 23 апреля 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Полифункциональные ферментные биопрепараты для разложения фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и лактонсодержащих индукторов развития устойчивых популяций бактерий, провоцирующих развитие заболеваний животных и растений в условиях сельскохозяйственного производства |
Результаты этапа: 1. Отобраны ферменты, способные деградировать различные по химическому строению микотоксины, и исследована возможность их совместного применения в комбинированных ферментных препаратах, осуществляющих детоксификацию разных микотоксинов. 2. Разработаны стабилизированные формы комбинированных ферментных препаратов и исследованы их каталитические характеристики в процессах деградации одновременно нескольких микотоксинов, способных присутствовать в сельскохозяйственном сырье и продуктах. 3. Разработаны комбинированные ферментные препараты на основе His6-OPH и других ферментов, гидролизующих АГЛ, с целью улучшения эффективности действия и расширения субстратной специфичности в отношении широкого круга грамотрицательных бактерий. 4. Разработаны комбинированные ферментные препараты на основе His6-OPH и пептидаз, гидролизующих пептиды-индукторы, с целью получения двойной активности (против грамположительных и грамотрицательных бактерий). 5. Исследована возможность введения дополнительных добавок в комбинированные ферментные препараты, деградирующие микотоксины. | ||
4 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Полифункциональные ферментные биопрепараты для разложения фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и лактонсодержащих индукторов развития устойчивых популяций бактерий, провоцирующих развитие заболеваний животных и растений в условиях сельскохозяйственного производства |
Результаты этапа: 1. Протестированы разработанные комбинированные препараты, деградирующие одновременно несколько микотоксинов, на клеточных линиях животных и человека in vitro. Определена эко- и цитотоксичность самих комбинированных препаратов, а также продуктов деградации микотоксинов, полученных в результате их действия, с использованием общепринятых стандартных тест-систем in vitro. 2. Разработаны комбинированные ферментные препараты на основе His6-OPH и миметиков пептидов, имитирующих индукторы грамположительных бактерий, с целью получения двойного действия (против грамположительных и грамотрицательных бактерий). Молекулярно смоделированы, получены и исследованы стабилизированные формы таких ферментных препаратов. Определена эффективность действия полученных препаратов (в комбинации с обычными антибиотиками и без них) в отношении различных грамположительных и грамотрицательных бактерий. 3. Исследовано влияние дополнительных добавок на эффективность действия комбинированных ферментных препаратов против грамположительных и грамотрицательных бактерий. 4. Проведены лабораторные испытания разработанных комбинированных препаратов, деградирующих одновременно несколько микотоксинов, на животных моделях. Будут разработаны наиболее эффективные способы и режимы введения полученных препаратов. 5. Протестирована эко- и цитотоксичность комбинированных ферментных препаратов против грамположительных и грамотрицательных бактерий с использованием общепринятых стандартных тест-систем in vitro. Оценена эффективность действия полученных препаратов в отношении различных популяций грамположительных и грамотрицательных патогенных бактерий in vivo. Разработаны наиболее эффективные способы и режимы введения полученных биокатализаторов в живые объекты. 6. Полученные результаты подготовлены к публикации и патентованию. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".