ИСТИНА

Изучение регуляции дифференцировки постнатальных стволовых клеток (СК) является одной из самых сложных задач в клеточной биологии и представляет интерес как для фундаментальной науки, так и для медицины. Постнатальные СК содержатся во всех тканях и являются основной движущей силой их обновления или восстановления после травм или болезней. Состояние и степень их дифференцировки контролируются специфическим микроокружением, которое получило название "ниши", предложенное R. Scofield в 1978 году. Современное развитие этой концепции привело к тому, что под функциональной единицей регенерации понимают именно СК в “нише”, компоненты которой определяют как покоящееся, так и активированное состояние клетки. При этом “ниша”, расположенная в строме (т.н. “стромальная ниша)”, где находится большая часть постнатальных СК, не имеет четкой анатомической локализации и представляет собой мигрирующий “фокус стимулов” в ткани. По этой причине исследование механизмов функционирования “ниши” in vivo (за исключением специализированных тканей - например, костного мозга), весьма затруднительно. Переход к общепринятой культуре СК in vitro также не решает этой проблемы в связи с тем, что вне ткани СК утрачивает контакт с матриксом и поддерживающими клетками “ниши”, а также лишается воздействия секретируемых пара- и аутокринных факторов. Действительно, часть этого микроокружения генерируется самими СК, однако в культуре объем среды превышает объем клеток на несколько порядков и действие наработанных клетками факторов нивелируется из-за их ничтожных концентраций. Решению этой задачи будет способствовать переход к использованию микрофлюидных систем, где микро- и нанолитровые объемы среды культивирования позволяют добиться условий и локальных концентраций ближе к физиологическим. Кроме того, управляя скоростью тока среды, можно добиться постоянного поддержания условий, в которых секретируемые факторы будут накапливаться в окружении клеток или удаляться с током свежей среды, разделяя таким образом “внутренние” и “внешние” стимулы для создания управляемой модели “ниши” СК. В проекте мы планируем использовать данный подход для создания “модельной ниши”, в которой будут выяснены механизмы регуляции дифференцировки постнатальных СК на примере адипоцитарной дифференцировки мезенхимных стволовых/стромальных клеток человека. В частности, предполагается изучить роль регуляторных молекул, продуцируемых самими СК (из семейства Wnt, TGF-beta и др.), а также оценить влияние окружения в микрофлюидной системе на скорость и эффективность дифференцировки с помощью репортерных конструкций, позволяющих вести прижизненное наблюдение за адипогенезом в клетках. Ожидаемые результаты проекта позволят расширить представления о механизмах контроля дифференцировки и мобилизации СК, а также создадут оригинальный методический задел для дальнейших исследований в этой области.

Study of the regulation of postnatal stem cells (SC) differentiation is a complicated task in cell biology and has significance for both - basic science and medicine. Postnatal SC are found in all tissues and present the main driving force of their renewal and recovery from trauma/disease. The state and degree of their differentiation are controlled by a specific microenvironment, which was called the "niche" (term coined by R. Scofield in 1978). Modern development of this concept led to a speculation that functional unit of regeneration is the SC in the "niche", which determines both - quiescent and activated state of the cell. "Niches" located in the stroma (the so-called "stromal niche"), where most of the postnatal SC resides, do not have distinct anatomical localization and form a migrating "focus of stimuli" in the tissue. For this reason, study of "niche" in vivo (with exception of specialized tissues - e.g., bone marrow) is very complicated. Transition to a conventional SC culture in vitro also does not solve this problem due to the fact that ex vivo, SC loses contact with the matrix and supporting "niche" cells, and is also deprived of the effects of secreted para- and autocrine factors. Indeed, part of this microenvironment is generated by the SC themselves, but in culture volume of the medium exceeds cell volume by several orders and action of factors produced by the cells is almost abolished due to insignificant concentrations. Solution to this problem will be facilitated by transition to a microfluidic system, where micro- and nanoliter volumes of the culture medium allow conditions and local concentrations closer to physiological. In addition, by controlling the flow rate of the medium, it is possible to maintain constant conditions in which secreted factors accumulate in the cell’sl environment or removed by influx of fresh medium, thus dividing "internal" and "external" stimuli to create a controlled model of the "niche" of the SC. In the project, we plan to use this approach to create a "model niche" in which mechanisms that regulate differentiation of postnatal SC will be elucidated using adipocyte differentiation of human mesenchymal stem/stromal cells as a sample system. In particular, it is proposed to study role of regulatory molecules produced by SC itself (from the Wnt family, TGF-beta etc.), and also to assess effects of environment in a microfluidic system on rate and efficacy of differentiation using reporter constructs that allow for intravital monitoring of adipogenesis in cells. Expected results of the project will expand our understanding of the mechanisms that control differentiation and mobilization of SC, as well as create original methodological basis for further research in this area.

В результате выполнения Проекта предполагается, что участвующий в нем новый коллектив получит определенный научный и методический приоритет, так как в России использование микрофлюидных подходов в контексте моделирования и контроля ниши СК является мало распространенным. Также предполагается получить следующие научные и практические результаты: 1. Будет разработана микрофлюидная “модельная ниша”, в которой будет налажена визуализация адпиогенной дифференцировки; на основе созданного подхода могут в дальнейшем создаваться модели для оценки других процессов и/или направлений дифференцировки СК. 2. В созданной “модельной нише” будет налажена методика индукции адипоцитарной дифференцировки МСК и способы ее прижизненной визуализации, а также и отработаны методы характеристики клеток и исследования их секреторной активности в зависимости от условий в “модельной нише”. 3. В “модельной нише” будет исследована роль секретируемых СК факторов в контроле дифференцировки и обновления постнатальных СК на примере МСК человека. 4. Результаты проекта заложат методическую и научную базу для дальнейшего изучения ниши постнатальных СК, являющихся одним из ключевых объектов клеточной биологии и регенеративной медицины. Разработанные подходы позволят получить новые данные о роли межклеточных взаимодействий и секретируемых факторов в регуляции обновления и регенерации организма человека. По итогам реализации проекта планируется опубликовать не менее 3-х работ в рецензируемых журналах, индексируемых в системах Web of Science или Scopus, а также представить ряд тезисов конференций, публикующихся в ведущих профильных изданиях. Результаты, касающиеся изучения ниши стволовых клеток, относятся к приоритетным в данной области и соотносятся с мировым уровнем исследований в клеточной биологии и регенеративной медицине.

Коллективом отработаны методы выделения и дифференцировки МСК жировой ткани, налажены модели оценки их активности in vivo, отработаны методы изучения их паракринной функции. Большинство сотрудников получили серьезную методическую и научную подготовку, в том числе и в рамках международных проектов, имеют опыт стажировок за рубежом (Италия, США, Германия, Китай) и постоянно публикуют свои данные в ведущих журналах. ФФМ и ИРМ располагают всем необходимым оборудованием для культуральной, и молекулярной работы, а также для культивирования МСК в разных форматах. На базе ИРМ имеются современный конфокальный микроскоп, оборудование для клеточного сортинга (магнитного и FACS), наборы реактивов и клеточных линий, при необходимости имеется доступ к современным ЦКП МГУ. Сотрудниками коллектива отработан ряд клеточных моделей для изучения процессов дифференцировки и функциональной активности МСК.