Изучение особенностей структурной организации центров связывания в ферментах патогенов и разработка новых антибиотиков для лечения заболеваний нижних дыхательных путей с использованием системных подходов биоинформатики и молекулярного моделированияНИР

Study of structural features of enzyme binding sites in pathogenic organisms and design of novel antibiotics to treat lower respiratory tract infections using systematic methods of bioinformatics and molecular modeling

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 26 мая 2015 г.-15 декабря 2015 г. Изучение особенностей структурной организации центров связывания в ферментах патогенов и разработка новых антибиотиков для лечения заболеваний нижних дыхательных путей с использованием системных подходов биоинформатики и молекулярного моделирования
Результаты этапа: В 2015 г. был разработан и апробирован комплексный подход, объединяющий возможности системной биологии, биоинформатики, молекулярного моделирования, теоретической химии и высокопроизводительных вычислений, для поиска ранее неизвестных участков связывания в структуре ферментов и оценки их функциональной значимости. Были получены расчетные и экспериментальные результаты, подтверждающие правильность выбранной концепции. В соответствии с разработанной методикой был проведен биоинформатический анализ и поиск in silico ранее неизвестных участков связывания для суперсемейств ферментов ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ, ТРАНСКЕТОЛАЗ, БАКТЕРИАЛЬНЫХ НЕЙРАМИНИДАЗ, L,D-ТРАНСПЕПТИДАЗ, ДНК-ЗАВИСИМЫХ РНК-ПОЛИМЕРАЗ. Для поиска лигандов, способных связываться в ранее известных и новых участках связывания выбранных ферментов, выбранных на основании результатов биоинформатического анализа, проводили компьютерный скрининг фокусированных in silico библиотек соединений, учитывающих особенности механизма действия и структурной организации выбранного участка связывания каждого фермента. Для изучения механизма взаимодействия ферментов с наиболее перспективными соединениями, отобранными в результате компьютерного скрининга библиотек, использовали молекулярную динамику. Проведенное моделирование позволяло уточнить тонкие детали механизма связывания и выявить пути дальнейшей оптимизации структуры ингибиторов. Наиболее перспективные ингибиторы бактериальных ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ, ТРАНСКЕТОЛАЗ и L,D-ТРАНСПЕПТИДАЗ были исследованы экспериментально. Экспериментальное исследование показало, что соединения ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ, отобранные на основании компьютерного исследования, обладают заметным ингибирующим действием на фермент из микобактерий, не оказывая существенного влияния на человеческий гомолог. Анализ литературы и базы данных DrugBank показал, что свойство обнаруженных нами соединений как ингибиторов ГАФД продемонстрированно нами впервые. Было проведено молекулярное моделирование комплексов ГАФД с лучшими ингибиторами, структуры оптимизированы с использованием методов молекулярной динамики, что помогло уточнить механизм связывания низкомолекулярного соединения. Показано, что селективность действия ингибиторов обусловлена наличием специфических позиций в новом сайте-мишени, обнаруженном с помощью биоинформатического анализа. Полученные результаты позволяют говорить о том, что обнаруженный нами новый сайт связывания в структуре ГАФД из Mycobacterium tuberculosis является перспективной мишенью для создания селективных ингибиторов, а структура полученных лидерных соединений будет оптимизирована для увеличения ингибирующего эффекта. Активность предложенных ингибиторов ТРАНСКЕТОЛАЗЫ была изучена экспериментально по отношению к ферментам из бактерий и дрожжей. Проведенные исследования показали, что отобранные соединения проявляют умеренную ингибирующую активность. Наиболее эффективные из исследованных нами ингибиторов ГАФД, L,D-транспептидазы и транскетолазы будут исследованы для определения их активности по отношению к патогенным микобактериям.
2 1 января 2016 г.-15 декабря 2016 г. Изучение особенностей структурной организации центров связывания в ферментах патогенов и разработка новых антибиотиков для лечения заболеваний нижних дыхательных путей с использованием системных подходов биоинформатики и молекулярного моделирования
Результаты этапа: Разрабатываемый подход, основанный на применении методов биоинформатики и системной биологии и ставящий своей целью определение ранее неизвестных участков связывания, существенных для функционирования ферментов, получил в 2016 году дальнейшее развитие, апробацию и экспериментальное подтверждение на примере глицеральдегид-3-дегидрогеназ и транскетолаз. В обоих случаях были выявлены ранее неизвестные участки связывания в структуре ферментов и найдены комплементарные к ним низкомолекулярные лиганды, способные избирательно ингибировать ферменты микроорганизмов, не подавляя активности гомологичных ферментов человека. Проверка влияния наиболее эффективных ингибиторов глицеральдегид-3-дегидрогеназы, транскетолазы и L,D-транспептидазы, отобранных по результатам компьютерного моделирования и экспериментальной проверки их ингибирующей способности по отношению к ферментам-мишеням, показала подавление роста культуры Mycobacterium tuberculosis. Установлена противотуберкулезная активность по крайней мере пяти предложенных соединений. Таким образом, были получены доказательства перспективности использования разрабатываемой методологии для поиска ингибиторов с ранее неизвестным механизмом действия для разных ферментов. Полученные результаты создают основу для оптимизации структур предложенных соединений и доказывают перспективность выбранного пути поиска новых антибиотиков. В 2016 г. усовершенствована методология поиска и характеристики новых участков связывания в структуре ферментов, оптимизирован протокол ее применения. Использование суперкомпьютера позволило увеличить производительность процедуры и проводить анализ больших библиотек ингибиторов с более высокой точностью, достигаемой за счет использования более аккуратного и ресурсозатратного алгоритма оценки энергии связывания, а также усовершенствования процедуры скрининга. Принципиальным дополнением разрабатываемой методологии, было усовершенствование стадии поиска комплементарных ингибиторов для конкретного участка связывания. Разработан метод скрининга библиотек ингибиторов, учитывающий взаимодействия соединений-кандидатов с аминокислотными остатками участка связывания, расположенными в специфических позициях подсемейств. Таким образом, роль специфических позиций подсемейств, выбранных нами ранее в качестве одного из ключевых критериев идентификации и ранжирования функциональных и регуляторных центров в структурах белков, была расширена на стадию определения структуры селективных ингибиторов.
3 2 января 2017 г.-15 декабря 2017 г. Изучение особенностей структурной организации центров связывания в ферментах патогенов и разработка новых антибиотиков для лечения заболеваний нижних дыхательных путей с использованием системных подходов биоинформатики и молекулярного моделирования
Результаты этапа: Задачи проекта на 2017 год выполнены полностью. Проведен критический анализ результатов, полученных за время выполнения проекта, что позволило провести оптимизацию разрабатываемой методологии и разработать усовершенствованную процедуру поиска участков связывания и комплементарных этим участкам селективных ингибиторов ферментов. Критический анализ полученных результатов и накопленного опыта показали, что для эффективной реализации идеи и методологии данного проекта, т.е. поиска ранее неизвестных участков связывания в структуре ферментов (в том числе ферментов патогенов), изучения особенностей их структурной организации в ферментах суперсемейства, выбора наиболее функционально важных участков и создания селективных ингибиторов, способных связываться на этих участках в конкретном ферменте, необходимо дальнейшее развитие методов биоинформатики и обеспечение их оптимального сочетания с методами молекулярного моделирования. Для этой цели в 2017 году была завершена разработка эффективно работающей программы, позволяющей выйти на структурно-опосредованные выравнивания тысяч белков/ферментов, и создан соответствующий веб-сервер (https://biokinet.belozersky.msu.ru/mustguseal). Наряду с этим, существенным дополнением разрабатываемого метода явился учет роли коэволюционирующих позиций (позиций, эволюционно связанных со специфическими позициями подсемейств), которые участвуют в формировании сети взаимодействий, определяющих взаимосвязь и роль отдельных участков связывания в структуре ферментов. Был создан соответствующий веб-сервер (https://biokinet.belozersky.msu.ru/visualcmat). Разрабатываемый подход выходит за рамки частной задачи поиска ингибиторов нескольких конкретных ферментов патогенов, и по своим возможностям представляет общую методологию дизайна лекарств. Принципиально важным достижением экспериментальной части работы в 2017 году было использование очищенных ферментных препаратов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, транскетолазы и L,D-транспептидазы из Mycobacterium tuberculosis. На предыдущих этапах при экспериментальном изучении ингибиторов использовали препараты гомологичных ферментов: глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы из Mycobacterium smegmatis и транскетолазы из дрожжей. Проведенные экспериментальные исследования показали, что наиболее перспективные ингибиторы, отобранные в результате компьютерного скрининга, были эффективны как по отношению к глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназе и транскетолазе из Mycobacterium tuberculosis, так и по отношению к гомологичным им глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназе из Mycobacterium smegmatis и транскетолазе из дрожжей. Проведена оптимизация структуры ингибиторов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, транскетолазы и L,D-транспептидазы и определены структуры соединений, обладающих наилучшими характеристиками по сочетанию эффективности ингибиторного действия и способности подавлять рост возбудителя туберкулеза. При компьютерном прогнозировании фармакокинетических свойств и токсичности разработанных ингибиторов транскетолазы, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и L,D-транспептидазы показана безопасность разработанных ингибиторов, что позволяет планировать предварительные исследования на животных моделях, а также обосновать выбор подходящих доз. В 2017 году был проведен синтез ряда лидерных соединений – ингибиторов L,D-транспептидазы, рекомендованных в результате компьютерного моделирования и скрининга, для экспериментального изучения ингибиторных свойств. Проведен дизайн ингибиторов второго поколения для ДНК-зависимой РНК-полимеразы и бактериальной нейраминидазы, определены наиболее перспективные соединения для дальнейшего экспериментального исследования. Исследован механизм действия обнаруженных ингибиторов по отношению к транскетолазе из Mycobacterium tuberculosis, проведен анализ взаимосвязи структуры и активности соединений. Методами компьютерного прогнозирования предсказаны фармакокинетические свойства и токсичность разработанных ингибиторов транскетолазы, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и L,D-транспептидазы.

Статьи по НИР

Доклады на конференциях по НИР