Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей средыНИР

Molecular design, structure-function analysis and regulation of enzyme systems, cellular structures, bionanomaterials: fundamental basis and applications in technology, medicine, environmental protection

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды
Результаты этапа: Изучены кинетические свойства двух новых лекарственных форм рекомбинантной стафилокиназы, разработанной в России. Разработаны методы ковалентной химической модификации двух активаторов плазминогена, используемых в медицине в качестве тромболитических агентов - стрептокиназы и про-урокиназы. Впервые показано, что артериальные и венозные тромбозы ассоциируются с 4G/5G полиморфизмом гена ПАИ-1 и высоким уровнем ингибитора в плазме крови у 79% пациентов с антифосфолипидным синдромом. Показаны высокие эффективность включения белков и сохранение активности каталазы при сорбции на поверхности микросфер, что м.б. использовано для получения белковых микрочастиц. Исследовано образование комплексов гликопротеина лактоферрина и антибиотика доксорубицина с полианионами рН. Этот подход перспективен для формирования рН-чувствительных биополиэлектролитных микрочастиц, пригодных для пероральной доставки биологически активных веществ. Оптимизировано получение микро- и наночастиц на основе лактата хитозана и альгината. Мукоадгезивные свойства и быстрое высвобождение капсулированных белков позволяют использовать эти частицы для интраназальной доставки. Для создания экспресс-методов идентификации антибиотикоустойчивых микроорганизмов разработаны: технология мультианализа генов и точечных мутаций в них на микрочипах; оригинальная методика модификации полистирола, позволяющая обеспечить ковалентную иммобилизацию олигонуклеотидных зондов. Разработанные микрочипы были испытаны и показали хорошую корреляцию с результатами классических микробиологических методов. Данный метод м. б. использован в клинических микробиологических лабораториях для характеристики возбудителей инфекционных заболеваний, эффективного инфекционного контроля и др. Изучена специфичность и аффинность взаимодействия антибиотиков с антителами, выбраны оптимальные антитела и трейсера. Созданы простые и быстрые методики детекции тетрациклинов и фторхинолонов в продуктах питания. Создана простая и быстрая методика определения тетрациклина и фторхинолонов в молоке. Исследована цитотоксичность и иммуногенность разработанных ферментных препаратов на основе гексагистидин-содержащей органофосфатгидролазы (His6-OPH) для нейтрализации фосфорорганических соединений (ФОС) in vivo с использованием современных биосенсорных и иммунологических методов.С применением биосенсоров в виде иммобилизованных клеток светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum показано, что все испытуемые образцы ферментных препаратов не обладают цитотоксичностью или иммуногенностью. Разработана техническая документация в виде лабораторных технологических регламентов на получение ферментных препаратов на основе His6-OPH для нейтрализации ФОС in vivo. При минимальной прибыли 800 тыс. руб. с 10 кг готового продукта средние расходы в расчёте на одного человека составят 240-290 руб. Проведена наработка партий лабораторных образцов ферментных препаратов на основе His6-OPH для нейтрализации ФОС in vivo. Проведена технико-экономическая оценка полученных результатов, касающихся разработанных наноразмерных ферментных биокатализаторов для детоксификации ФОС in vivo. Возможный ежегодный доход от производства и реализации таких ферментных препаратов может достигать 1 млн.руб. Разработано предложение на проведение ОТР по получению ферментных препаратов на основе His6-OPH для нейтрализации ФОС in vivo двойного (терапевтического и защитного) назначения в виде Технического задания на проведение данной ОТР. Продолжены полевые испытания аэробно-анаэробной технологии очистки загрязненных аварийно разлитой нефтью топких болот в Западной Сибири с применением различных акцепторов электронов - мониторинг процесса восстановления загрязненного нефтью верхового болота после применения метода аэробно-анаэробной биорекультивации. Положительные результаты этого нового метода подтвердились. Предложена кинетическая схема функционирования двудоменного АПФ в реакциях гидролиза данных субстратов в условиях торможения ферментативной активности различными ингибиторами. Выявлена критическая область на N-домене АПФ, видимо, отвечающая за различия во влиянии связывания лигандов различной структуры в активном центре фермента на эффективность связывания мАт, то есть на конформацию поверхности белка. Разработан подход, позволяющий экспериментально определять физико-химические параметры адсорбции бактериолитических ферментов в условиях проведения ими катализа. Совместный анализ кинетических данных ферментативного лизиса бактериальных клеток и параметров сорбции в разных условиях необходим для определения вклада продуктивной и непродуктивной сорбции, в том числе для сорбции на мембраносвязанном бактериальном ингибиторе лизоцима. Были исследованы конденсаты выдыхаемого воздуха 100 доноров - пациентов с диагнозом «рак легких» и контрольных групп доноров методами масс-спектрометрии высокого разрешения в качестве скринингового этапа ранней диагностики рака легких среди населения. Работа проводилась совместно с врачами отдела торакальной хирургии Московского онкологического института им. Герцена. У онкобольных с раком идентифицированы несколько белков, не встречающихся у здоровых доноров и доноров с ХОБЛ и пневмонией. Было сделано предположение, что анализ выдыхаемого воздуха - идеальный кандидат для скрининговых программ, открывающий новые возможности в области персонализированной медицинской диагностики. Совместно с Институтом медико-биологических проблем РАН и Центром подготовки космонавтов им. Ю.А. Гагарина была продолжена первичная обработках проб российских космонавтов, участвующих в длительных полетах на МКС. Предложен новый формат мембранного носителя для пробоподготовки, транспортировки, хранения и анализа сухих образцов биологических жидкостей, позволяющий упростить процедуру пробоотбора и последующего проведения анализа. Разработан новый вид устройства для взятия, хранения и транспортировки проб биологических жидкостей (кровь, сыворотка, моча, лимфа, пот, молоко, вытяжки тканей и т.д.) с целью последующего проведения анализа материала на содержание биологически активных веществ методами ИФА-диагностики, ПЦР и др. Предложенный подход к получению сухих пятен был апробирован для целей медицинской и ветеринарной дистанционной диагностики методами ИФА и ПЦР. С использованием мембранной системы нового формата для сбора образцов проведено определение вируса лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в сухих пятнах крови. Показано, что провирусная ДНК в сухих пятнах крови сохраняет стабильность при хранении в течение 8 суток при 37оС и 24 часов при 60оС. Проведена апробация технологии получения сухих пятен биологических жидкостей для диагностики ряда вирусных заболеваний птицы. Новый подход в получении сухих пятен биологических жидкостей может стать основой для масштабного отбора биопроб в местах массового содержания животных при проведении скрининговых диагностических исследований, а также для персонифицированного дистанционного анализа. Для создания технологий производства отечественных экспресс-тестов разработаны экспресс-методы проточного латерального иммуноанализа использованием в качестве меток ферментов, наночастиц металлов, квантовых точек для определения прогестерона в молоке коров с целью раннего определения стельности были успешно апробированы на образцах молока в подмосковных хозяйствах. Проведена работа по оптимизации условий выращивания культуры клеток E.coli для изучения действия бактериолитического фермента лизоцима. Существенной для получения воспроизводимых результатов оказалась температура хранения клеток -70о С. Разработан суперстабильный электрокатализатор селективного восстановления пероксида водорода на основе гексацианоферратов железа и никеля, на его основе созданы наиболее чувствительные и стабильные сенсоры на пероксиды. Исследована иммобилизация лактатоксидазы в различные матрицы для создания лактатного биосенсора, адаптированного для диапазона концентраций физиологического содержания лактата в поте. Создан биосенсор, позволяющий анализировать неразбавленный пот. На основе биосенсора и потосборника создан прототип неинвазивного монитора состояния гипоксии. Продолжена разработка биосенсора для совместного определения глюкозы и лактата в образцах крови в тонкослойной проточно-инжекционной ячейке для целей клинической диагностики. Впервые продемонстрирован эффект понижения сопротивления полимера при связывании боронатной группы с полиолами. Полученный эффект противоположен неспецифическому связыванию и возможной деградации полимера. На основе разработанных встречно-штыревых микроэлектродных структур создан прототип сенсора для детекции микроорганизмов на примере Penicillium chrysogenum. Для конъюгатов L-аспарагиназы с со-полимерами изучена противоопухолевая активность на культурах клеток in vitro в сравнении с коммерческими лекарственными препаратами нативной и пегилированной форм L-аспарагиназ E.coli и Erwinia сhrisanthemi. Полученные результаты послужат основой для разработки нового ферментного препарата с улучшенными биофармацевтическими свойствами. Исследование возможностей использования нового подхода к регуляции каталитических свойств ферментов медицинского назначения. Впервые будут синтезированы и изучены конъюгаты EwA с ПЭГ-хитозаном, различающиеся по структуре и составу. Конъюгаты охарактеризованы по составу и степени очистки с использованием методов видимой-УФ спектрофотометрии, ИК спектроскопии и ВЭЖХ. Разработка новых чувствительных экспресс методов определения каталитических параметров L-аспарагиназы в составе конъюгатов с ПЭГ-хитозаном позволит проводить высокопроизводительный анализ модифицированных форм аспарагиназы. Впервые исследовано влияние молекулярной архитектуры со-полимера, на каталитические свойства, субстратную специфичность и стабильность фермента к протеолитической деградации в системах in vitro. Химический дизайн бионаноматериалов - для медицинских применений. Разработаны лабораторные технологические регламенты на получение нанозимных препаратов против токсического действия фосфорорганических соединений. Продемонстрировано достоверное улучшение клинических проявлений иммуногенного увеита у кроликов в результате местных инстилляций суспензии кальций-фосфатных частиц, нагруженных лизиноприлом и СОД. Показана высокая эффективность разработанных многослойных нанозимов-антиоксидантов на восстановление двигательных функций и нервной ткани после травмы спинного мозга. Разработаны фармкомпозиции бактериолитических нанозимов на основе антистафилококковых бактериолитических ферментов. Получены: методики получения магнитных наночастиц различного размера и морфологии, характеризация свойств (электронная микроскопия, динамическое светорассеяние и др.); методики функционализации магнитных наночастиц лигандами различной химической природы и характеризация свойств; методика коньюгирования олигонуклеотидов к магнитным наночастицам, покрытых золотом; методика получения кальций-фосфатных наночастиц, нагруженных лизиноприлом и СОД; лабораторные технологические регламенты на получение нанозимных препаратов против токсического действия фосфорорганических соединений; лабораторные образцы рекомбинантной формы органофосфатгидролазы His6-OPH для получения нанозимных антидотов на ее основе; лабораторные образцы кальций-фосфатных наночастиц; лабораторные образцы кальций-фосфатных наночастиц, нагруженных лизиноприлом и СОД для проведения биологических испытаний на животных; лабораторные образцы многослойных антиоксидантных нанозимов на основе комплекса СОД-поликатион/полианион (протамин-ПЭГ), стабилизированного ГА, для проведения биологических испытаний на животных; лабораторные образцы магнитных наночастиц, содержащих ферменты различных классов; лабораторные образцы магнитных наночастиц различного размера и морфологии, содержащих магнитное ядро и иммобилизованные лиганды; лабораторные образцы магнитных наночастиц, нагруженных противоопухолевыми препаратами (доксорубицин); лабораторные образцы бактериолитических антистафилококковых нанозимов. В ходе выполнения работы исследованы режимы сборки и свойства микрогелевых и микрогель/ферментных тонких пленок, адсорбированных на проводящие субстраты (графит, золото). Обнаружено значительное увеличение количества адсорбирующейся тирозиназы, если матрицу микрогеля сначала приводили в сколлапсированое состояние, а затем проводили адсорбцию с ферментом. За счет индуцированной температурой стимуляции адсорбции поли(НИПАМ-co-ДМАПМА) микрогеля и последующей адсорбции удалось достичь более чем 3,5-кратного увеличения чувствительности определения фенола по сравнению с нестимулированной адсорбцией. Таким образом, предложен новый простой и быстрый способ физического включения биомолекул в полимерную гидрогелевую матрицу. Исследованы возможности новых метаматериалов на основе фасетчатых структур диоксида церия для усиления сигнала гигантского комбинационного рассеяния в целях создания высокочувствительных биосенсоров. Разработан метод определения нейротоксинов в водной среде с использованием сенсоров на основе наночастиц диоксида марганца. Исследованы режимы сборки и свойства микрогелевых и микрогель/ферментных тонких пленок, адсорбированных на проводящие субстраты (графит, золото). Создан новый алгоритм оценки размеров наночастиц в методе АТН. Разработан метод локализации ферментов в составе тонких пленок. Для проведения структурно-функционального анализа механизма действия лакказ, оптимизирован метод спектроэлектрохимического титрования редокс потенциала Т1-центра этих ферментов и определены потенциалы St. bordotii,St. murashkinsky, J. nitida, T.hirsuta. Исследованы возможности терагерцевой спектроскопии для изучения конформационных изменений белка на примере химотрипсина и альбумина. Проведены работы по поиску аптамеров, которые в комплексе с гемином обладают высокой пероксидаза-подобной активностью. В качестве субстрата и регистрирующего сигнала использовали люминол и хемилюминесценцию соответственно. Показано, что аптамер EAD2 является наиболее активным активатором гемина. В целях создания высокоактивных ферментных комплексов целлюлаз и гемицеллюлаз, а также ферментов негидролитической природы, усиливающих гидролитическое действие карбогидраз, для превращения в сахара, спирты и органические кислоты углевод-содержащих отходов промышленности и сельского хозяйства получены результаты: определён компонентный состав новых промышленных ферментных препаратов серий Cellic CТec (Novozymes), Accellerase (DuPont&Genencor) на основе гриба рода Trichoderma reesei и Myceliophtora thermophila C1 (Dyadic International, Inc), специально созданных для эффективного гидролиза целлюлозосодержащего сырья. Выделены целевые гены сволленина и энхансера из геномной ДНК низшего гриба T.reesei. В результате трансформации получено порядка 200 колоний каждого рекомбинантного штамма. Проведена наработка отобранных штаммов в малых объемах. Получены образцы жидких и сухих форм ферментных препаратов P.verruculosum, содержащих сволленин или энхансер T.reesei. Из сухих форм ферментных препаратов с применением различных хроматографических методов выделены гомогенные формы исследуемых белков. Обнаружено, что присутствие ЭГIV T.reesei в реакционной смеси повышает выход продуктов гидролиза МКЦ и измельченной осиновой древесины целлюлазным комплексом P.verruculosum на 70% и 40%, соответственно. Продолжены работы по исследованию взаимосвязи структура-функция ряда значимых ферментов – формиатдегидрогеназы, пероксидазы, оксидазы Д-аминокислот, пенициллинацилазы, гидролазы эфиров альфа-аминокислот. В случае формиатдегидрогеназы клонирован ген фермента из патогенных бактерий Staphylococcus aureus. Ген клонирован в двух формах – полноразмерной и укороченной, проведена их очистка и изучены каталитические свойства и термостабильность. Показано, что полноразмерная форма обладает более высокой стабильностью и активностью. Кроме того, по своей стабильности полноразмерная форма уступает только формиатдегидрогеназе из бактерий Pseudomonas sp.101. Начаты эксперименты по кристаллизации этого фермента. Для оксидазы Д-аминокислот проведены эксперименты по стабилизации фермента за счет гидрофобизации альфа-спиралей. Получено 8 мутантов с заменой остатков серина на остатки. Показано,что две замены приводят к повышению стабильности фермента. Для этого фермента также оптимизированы условия определения активности с цефалоспорином С с помощью хроматографии высокого давления. В случае пенициллинацилазы было проведено культивирование, выделение и изучены свойства ряда мутантов фермента, полученных с помощью error prone PCR. Показано, что введенные мутации в ряде случаев повышают каталитическую активность, но ухудшают стабильность. В случае гидролазы эфиров альфа-аминокислот из бактерий рода Xantomonas проведено исследование эффективности этого фермента в синтезе двух бета-лактамных антибиотиков. Проведена оптимизация условий процесса и получены выходы более 70%. Получены мутанты термостабильной мутантной люциферазы (TS люциферазы) светляков L. mingrelica со следующими заменами: E457V, E457D, E457Q, и E457K, а также с заменой A534R. Созданы компьютерные модели TS люциферазы для объяснения эффекта полученных мутаций на свойства фермента. Разработана новая специфическая матрица для сорбции клеток Salmonella: монодисперсные полистирольные микрочастицы (φ 240 нм) были покрыты Плюроником F108-PDS, с которым затем ковалентно были связаны моноклональные антитела к клеткам Salmonella (Sal). Конъюгаты Luc-Sal примены как детектирующие агенты в биолюминесцентном иммуноанализе клеток Salmonella. Использование новой матрицы и высокоактивных конъюгатов Luc-Sal позволило значительно повысить чувствительность метода по сравнению со стандартным «сэндвич»-методом. Выявлен гибридный белок, His6-SA-Luc, с оптимальными свойствами, который использован для селективной детекции ДНК методом гибридизационного анализа на примере биотинилированного фрагмента гена gadB, кодирующего глутамат декарбоксилазу клеток E. сoli. Оптимизирована методика удаления свободного АТФ из культуральных жидкостей и клеточных суспензий апиразой картофеля. Разработан быстрый биолюминесцентный метод определения внутриклеточного АТФ в лиофилизованных микробных клетках. Установлена хорошая корреляция биолюминесцентного метода с классическим методом посева разведений.
2 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды
Результаты этапа: Показано, что низкочастотный интервал Рамановских и ИК спектров белков можно использовать для характеристики конформации белков. Показано, что гидролитическая способность целлюлазных препаратов увеличивается в результате введения в их состав ферментов негидролитического типа действия (полисахаридмонооксигеназ), на основе рекомбинантного штамма гриба Penicillium verruculosum несущего ген эндоглюканазы IV Trichoderma reesei, был получен ферментный препарат с увеличенной на 20% гидролитической способностью. Развиты подходы получения блок-иономерных фермент-содержащих бионаноматериалов, основанные на технологии NanoZyme. Получены наноформуляции на основе двухслойных наночастиц состава супероксиддисмутаза СОД1-поликатион-полианион, позволяющие существенно увеличить степень включения белка (с 20% до 70%), повысить эффективность работы фермента (до 70%), а также снизить цитотоксичность. На животных моделях показано, что введение улучшает динамику восстановления произвольных движений при контузионных травмах спинного мозга. Разработан высокочувствительный метод гомогенного конкурентного иммуноанализа прогестерона на основе BRET. Разработан метод биолюминесцентной детекции жизнеспособных микробных сообществ в образцах почв вечной мерзлоты. Разработан биолюминесцентный метод определения специфической активности по содержанию внутриклеточного АТФ в вакцинах на основе жизнеспособных клеток микроорганизмов. Метод применим как для суспензионной, так и для лиофилизованной формы вакцин. По сравнению с традиционным методом посева разведений предложенный метод характеризуется более высокой точностью, воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью и позволяет значительно сократить длительность анализа, что особенно важно для медленно растущих микроорганизмов. Например, для микробактерий длительность анализа сокращается с 28 - 30 дней до 2 - 3 часов. Создана система экспрессии гена бета-лактамазы NDM-1 в клетках E.coli, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка в растворимой активной форме. Разработан метод выделения и очистки рекомбинантного фермента. Определены каталитические параметры рекомбинантной бета-лактамазы NDM-1. В экспериментах in vitro, выявлено снижение скорости гидролиза бета-лактамного антибиотика меропенема рекомбинантным ферментом NDM-1 в присутствии соединений АМ 2015-1 и АМ 2015-2, установлен механизм конкурентного обратимого ингибирования данными соединениями. Значения констант ингибирования в 2-20 раз лучше препаратов ингибиторов карбапенемаз, описанных в литературе. Исследование эффективности новых препаратов на культурах возбудителей проведено ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора (Оболенск, Моск. обл.). В присутствии новых ингибиторов металло-бета-лактамаз данные бактерии станут чувствительными к карбапенемам. Впервые разработаны методики проведения ИФА и ПЦР с использованием сухих пятен крови для диагностики лейкоза КРС. Методами ИФА и ПЦР тестировали образцы жидкой крови взрослых особей, а также крови, полученной в виде сухих пятен. Сходимость результатов, полученных методами ИФА и ПЦР, составила 93,1%. Разработан новый быстрый метод латерального проточного иммуноферментного анализа (ЛПИФА)для определения прогестерона в цельном молоке коров. В качестве метки в тест-системе использована пероксидаза хрена, в качестве субстрата - раствор 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина. Время проведения ЛПИФА составило 15 минут, предел обнаружения - 0,8 нг/мл. Разработан экспресс-метод латерального проточного иммуноанализа маркера сепсиса прокальцитонина с использованием в качестве метки коллоидного золота. Чувствительность метода составляет 1 нг/мл прокальцитонина в буферном растворе. Проведены химические исследования образца почвы с остаточным нефтяным загрязнением, которое отмывали несколькими концентрациями различных ПАВ, применяемых для отмывания шламов от углеводородов на УПНШ. По результатам тестирования были выбраны три наиболее эффективных ПАВ и их оптимальные концентрации. Выданы рекомендации по применению наиболее эффективных ПАВ. В лабораторных условиях смоделировано разложение нитроцеллюлозы (НЦ) из осадков сточных вод под действием аэробных и анаэробных микроорганизмов, как с добавлением фермента нитроцеллюлазы, так и без нее с применением добавки биогенного элемента – гумата в нескольких концентрациях. Было показано, что в аэробных условиях жидкофазной ферментации процесс разложения НЦ происходит быстрее. За 31 сутки проведения процесса эффективность разложения НЦ составила 55,1%. Сочетание жидкофазной и твердофазной обработки НЦ с использованием ферментного препарата показало самые высокие результаты. Проведено исследование влияния N-гликозилирования на каталитическую активность и другие свойства целлобиогидролазы I из гриба Penicillium verruculosum. Был осуществлен сайт-направленный мутагенез данного фермента (удаление сайтов N-гликозилирования путем замены соответствующих остатков Asn на Ala) и показано, что N-связанные гликаны не просто влияют на активность фермента при действии на различные субстраты, но и являются важной частью сложного процессивного механизма гидролиза полимерного субстрата целлобиогидролазами. Проведено исследование влияния N-гликозилирования на каталитическую активность и другие свойства целлобиогидролазы I из гриба Penicillium verruculosum. Был осуществлен сайт-направленный мутагенез данного фермента (удаление сайтов N-гликозилирования путем замены соответствующих остатков Asn на Ala) и показано, что N-связанные гликаны не просто влияют на активность фермента при действии на различные субстраты, но и являются важной частью сложного процессивного механизма гидролиза полимерного субстрата целлобиогидролазами 7-й семьи гликозидгидролаз. Проведены исследования с целью улучшения гидролитической способности секреторного ферментного комплекса Penicillium verruculosum с помощью добавления к нему методами генетической инженерии гомологичных и гетерологичных целлюлаз в различных комбинациях и соотношениях – эндоглюканазы IV (EGIV) Trichoderma reesei, эндоглюканазы II (EGII) и целлобиогидролазы I (CBHI) P.verruculosum, а также бета-глюкозидазы (b-GLU) Aspergillus niger. Определено оптимальное соотношение компонентов, позволившее добиться увеличения каталитической активности новых ферментных комплексов до двух раз. Отработана методика регистрации методом сканирующей силовой микроскопии малых изменений высоты белковых молекул, иммобилизованных на поверхности. Выявлены мешающие факторы (наводки электросети, вибрации здания), отработаны режимы получения временных зависимостей флуктуаций высоты белковой глобулы. Проанализированы конденсаты выдыхаемого воздуха 20 больных раком легкого различной степени и локализации. Составлен список из 19 белков, идентифицируемых только в пробах онкологических больных. Собраны и проанализированы 11 наборов проб космонавтов, участвующих в работе на МКС. Разработан высокочувствительный и высокостабильный сенсор на основе одного бислоя, состоящего из каталитического покрытия берлинской лазури и стабилизирующего покрытия гексацианоферрата никеля. Разработан высокочувствительный и высокостабильный биосенсор для определения лактата,примененимый для разбавленных образцов крови и пота на основе планарных электродов, модифицированных берлинской лазурью, и лактатоксидазы, иммобилизованной в мембрану γ-аминопропилсилоксана. Создана новая электроаналитическая система для детекции микроорганизмов на основе новых сенсорных материалов - поли(анилинборных) кислот. Разработаны методики определения ферментативного гидролиза холин- и тиохолинсодержащих субстратов. Были оптимизированы условия синтеза ковалентного пероксидаза-подобного ДНКзима и изучены его свойства. Было показано, что максимальная чувствительность определения ДНК-зима достигается при добавлении линкера (ножки) Т10. Исследована адсорбция и соосаждение биологически активных веществ, включая белки, ферменты и гормоны при получении микрокапсул послойной адсорбцией биополиэлектролитов с использованием наноструктурированных микросфер карбоната кальция в форме ватерита. Изучены мукоадгезивные свойства микросфер карбоната кальция. Выбран метод получения полиэлектролитных микрокапсул из декстрансульфата и протамина с использованием микросфер карбоната кальция с максимальными включением ферментов и сохранением их биологической активности. Обсуждены перспективы использования биополиэлектролитных микрочастиц с белками. Подобраны концентрации реагентов для получения кальций-фосфатных частиц с относительно небольшим (110 -160 нм) гидродинамическим радиусом. Показано, что внедрение СОД в частицы приводит к повышению гидродинамического радиуса до 210-250 нм и снижению (по модулю)дзета-потенциала с -16 мВ до -4 мВ. Эффективность внедрения СОД составила около 50%. СОД-содержащие частицы в лиофильно высушенном состоянии могут храниться по крайней мере в течение полугода без потери физико-химических свойств и ферментативной активности. Показано, что СОД в составе частиц проявляет лучшее терапевтическое действие при лечении иммуногенного увеита, чем СОД в растворе, по таким параметрам, как отек и гиперемия век и образование задних синехий (стяжек), а также количество фибриновых сгустков, которые приводят к значительному снижению зрения. Выявлены различия в механизмах тромболитических и побочных эффектов стрептокиназы и стафилокиназы. Показана взаимосвязь изменения закрытой конформации плазминогена в открытую в результате его связывания с фибрином или рецепторами на различных типах клеток и вовлечения системы плазмин/плазминоген в развитие различных физиологических и патологических процессов. Разработаны методы контролируемой ковалентной модификации активаторов плазминогена полимерами, приводящие к повышению стабильности в плазме человека и снижению побочных эффектов тромболитических агентов. Обнаружено, что при комбированном действии тканевый активатор плазминогена потенциирует тромболитический эфект стафилокиназы. Впервые в плазме крови онкологических пациентов выявлены IgG, специфично связывающиеся с плазминогеном. Проводится молекулярный дизайн и получение новых флуоресцеин-меченных соединений, которые позволяют разрабатывать более чувствительный поляризационный флуоресцентный иммуноанализ загрязнителей в пищевых продуктах Продолжены работы по исследованию взаимосвязи структура-функция ряда значимых ферментов – формиатдегидрогеназы, пероксидазы, оксидазы Д-аминокислот. В случае формиатдегидрогеназы клонирован ген фермента из дрожжей Ogatea parapolymorpha. Проведена экспрессия фермента в клетках E.coli, проведена их очистка и изучены каталитические свойства и термостабильность. В случае пероксидазы проведена оптимизация методики реактивации фермента из телец включения, что позволило повысить выход до 14 раз. Для оксидазы Д-аминокислот проведены эксперименты по направленному мутагенезу с целью повышения стабильности. Получены новые мутантные формы по ряду остатков.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".