ИСТИНА

«БЫСТРАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ» В БИОТЕХНОЛОГИИ Н.Н. Угарова, Г.Ю. Ломакина Химический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова, ГСП-1, Москва, 119991, Россия Микробиологические методы широко применяются в биотехнологии для определения специфической активности биомассы и биотехнологических продуктов на основе жизнеспособных клеток микроорганизмов, для контроля содержания микробных загрязнений в пищевых продуктах, напитках, на поверхности технологического оборудования и в окружающей среде. Несмотря на их высокую чувствительность, они имеют существенный недостаток: результат (подсчет выросших колоний) получают после длительной инкубации анализируемого образца (от нескольких часов до нескольких недель) на твердой или жидкой питательной среде. Необходимость внедрения методов так называемой «быстрой микробиологии», при использовании которой длительность анализа сокращается до нескольких часов или даже минут, была осознана десятки лет назад. Одним из таких быстрых методов является метод биолюминесцентной АТФ-метрии. Содержание АТФ пропорционально количеству жизнеспособных клеток в образце, поэтому измерение АТФ позволяет количественно определять содержание именно живых клеток в отличие от методов, основанных на измерении других внутриклеточных индикаторных метаболитов (глюкоза, аминокислоты и т.д.). Для измерения АТФ используется ферментативная система, так называемая биолюминесцентная люциферин-люциферазная система светляков, для которой свечение наблюдается только в присутствии АТФ. Благодаря высокой специфичности и чувствительности данной системы метод биолюминесцентной АТФ-метрии стал основой так называемой "БЫСТРОЙ МИКРОБИОЛОГИИ". По сравнению с традиционными микробиологическими тестами метод "БЫСТРОЙ МИКРОБИОЛОГИИ" позволяет в десятки раз сократить длительность анализа и резко снижает его трудоемкость. В докладе детально рассмотрены методики измерения концентрации АТФ в суспензии микроорганизмов. Они включают удаление внеклеточного (свободного АТФ) фильтрованием образца через бактерицидный фильтр, либо разрушение свободного АТФ с помощью фермента – апиразы. Затем микробные клетки лизируют с помощью ионных детергентов, либо органических растворителей для перевода внутриклеточного АТФ в раствор и, наконец, измеряют АТФ с помощью АТФ-реагентов на высокочувствительных приборах - люминометрах. Важным этапом при определении внутриклеточного АТФ является построение градуировочной зависимости между концентрацией внутриклеточного АТФ и концентрацией клеток в образце. С помощью стандартного метода посевов определяют содержание жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) и параллельно с помощью биолюминесцентного метода - содержание АТФ в 1 мл образца (АТФ/мл). Эти градуировочные зависимости затем используют для нахождения величины (КОЕ/мл) по величине (АТФ/мл). Для суспензии микробных клеток одного и того же штамма, находящихся в активном метаболическом состоянии, обычно наблюдается хорошая линейная корреляция между содержанием АТФ/мл и КОЕ/мл в интервале от 102 до 108 КОЕ/мл с r2 ~ 0,9. Если анализируемый образец содержит жизнеспособные немикробные (соматические) клетки, то их предварительно разрушают с помощью мягких неионных детергенов, затем высвободившийся АТФ из немикробных клеток удаляют фильтрованием либо разрушают апиразой. Успех в применении биолюминесцентного метода АТФ-метрии во многом зависит от правильной пробоподготовки образца, которая определяется составом анализируемого образца. В докладе это показано на примере ряда реальных образцов (вода, молоко, бактериальные вакцины), для которых методы биолюминесцентного определения КОЕ/мл по содержанию АТФ были разработаны в нашей лаборатории.