ИСТИНА

В 2019-2020 гг. продолжены фундаментальные исследования в области физико-химии ферментов, биохимии и биотехнологии. Целью работ по данной госрегистрационной тематике является повышение качества выпускаемой продукции и совершенствование процессов производства. Ряд проведенных исследований был направлен на использование ферментов в медицине, фармакологии, пищевой промышленности, в аналитических целях и др. Изучено влияние физико-химических и биотехнологических параметров на эффективность конверсии биомассы в летучие жирные кислоты и этанол. Проводились работы по созданию высокоэффективных (био)сенсоров на основе наноразмерных пленок электро- и биокатализаторов. Также проводились исследования, направленные на создание систем доставки лекарственных средств с использованием экзосом для лечения нейродегенеративных заболеваний и рака. Были проведены разработки новых наноформуляций на основе нанозимов SOD1 для лечения острой фазы травмы спинного мозга с использованием макрофагов как средств направленной доставки в область воспаления. В лаборатории «Химический дизайн бионаноматерилов» продолжены разработки бионаносистем с использованием белков, ферментов, полимеров, мицелл, металлических наночастиц, имеющих значение как для решения фундаментальных проблем химической энзимологии, так и для практических медицинских применений. Нанозимы SOD1 с двойным покрытием показали значительную терапевтическую активность при лечении воспалительных заболеваний глаз. Созданные и наработанные в достаточных количествах на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ образцы препаратов были переданы в ООО «МедНаноТех» для проведения доклинических испытаний, которые были успешно завершены. В экспериментах по определению внутриклеточного АФК было выявлено, что в опухолевых клетках наблюдается повышенный уровень активных форм кислорода по сравнению со здоровыми. Определены высокоаффинные лиганды для конструирования платформы направленной векторной доставки лекарств в гепатоциты (и иные клетки, экспрессирующие исследуемый рецептор, такие, как клетки гепатоцеллюлярной карциномы) путём рецептор-опосредованного эндоцитоза. Также целью работ по данной госрегистрационной тематике является повышение качества выпускаемой продукции и совершенствование процессов производства, например, лекарственного препарата: «БЦЖ вакцина противотуберкулезная». Проведен анализ результатов производственных испытаний на предприятии фирмы Микроген разработанного биолюминесцентного АТФ-метода для оперативного контроля активности противотуберкулезной БЦЖ вакцины. Использованный метод позволил сократить время анализа с 28 суток до 1 часа. Впервые проанализировано влияние муцина на формирование гибридных микросфер ватерита и включение антрациклинового антибиотика доксорубицина и низкомолекулярных белков - апротинина и инсулина. Полученные результаты по созданию гибридных муцин-ватеритных микросфер могут быть практически важными для создания мукозальных систем доставки лекарственных веществ. Разработан новый способ амплификации аналитического сигнала в гибридизационном анализе ДНК на биочипах с наночастицами золота в качестве метки. Были проведены разработки по использованию биолюминесцентных методов для изучения влияния клеточного стресса на жизнеспособность живых клеток. Целью исследований было определение высокоаффинного лиганда для конструирования платформы направленной векторной доставки лекарств в гепатоциты (и иные клетки, экспрессирующие исследуемый рецептор, такие, как клетки гепатоцеллюлярной карциномы) путём рецептор-опосредованного эндоцитоза. Ряд проведенных исследований был направлен на использование ферментов в промышленности. Были изучены подходы к использованию свекловичного жома, который является побочным продуктом переработки сахарной свеклы и представляет собой один из видов возобновляемого растительного сырья, характерного для РФ. Аналитические характеристики полученных ферментных биосенсоров изучены методами электрохимии. Оптимизирован процесс получения максимального количества летучих жирных кислот (ЛЖК) и этанола на наиболее перспективных образцах биомассы (пшеничная солома и мискантус) модифицированным биокатализатором при подобранной высокой концентрации субстратов и температуры проведения процесса биоконверсии с последующей этерифицикацией их в суперкритическом этаноле. Эти результаты можно напрямую использовать при организации полупромышленного производства ЛЖК и этанола для нужд промышленности из отходов агропромышленного комплекса (АПК) и другого возобновляемого сырья.

In 2020, fundamental research will be continued in the field of physical chemistry of enzymes, biochemistry and biotechnology. The aim of the work on this state registration topic is to improve the quality of products and improve production processes, as well as improve the quality of products and improve production processes, for example, of a drug: “BCG vaccine against tuberculosis”. A number of studies are aimed at the use of enzymes in medicine, pharmacology, the food industry, for analytical purposes, etc. The effect of physicochemical and biotechnological parameters on the efficiency of the conversion of biomass to volatile fatty acids and ethanol has been studied. Work is underway to create highly efficient (bio) sensors based on nanoscale films of electro- and biocatalysts; studies aimed at creating drug delivery systems using exosomes for the treatment of neurodegenerative diseases and cancer; to develop new nanoformations based on SOD1 nanozymes for the treatment of the acute phase of spinal cord injury using macrophages as a means of targeted delivery to the area of inflammation. Work continues on the development of bionanosystems using proteins, enzymes, polymers, micelles, metal nanoparticles, which are important both for solving fundamental problems of chemical enzymology and for practical medical applications; it was found that in tumor cells there is an increased level of reactive oxygen species compared to healthy ones; on the use of bioluminescent methods to study the effect of cell stress on the viability of living cells. For the first time, the effect of mucin on the formation of hybrid vateritis microspheres and the inclusion of the anthracycline antibiotic doxorubicin and low molecular weight proteins, aprotinin and insulin, were analyzed. A number of studies have been directed to the use of enzymes in industry. A number of results can be directly used in the organization of semi-industrial production of VFA and ethanol for the needs of industry from agricultural wastes (AIC) and other renewable raw materials.

Будет проведён структурно-функциональный анализ моно- и мультиферментных систем для решения актуальных проблем науки, технологии, медицины, защиты окружающей среды. Будут проанализированы и адаптированы подходы к получению иммобилизованных биокатализаторов на основе таких систем. Будут исследованы возможности применения биокатализаторов в ходе решения приоритетных задач. Исследовать взаимодействие ферментов с формируемыми в водных растворах комплексными макромолекулярными структурами, образуемыми противоположно заряженными макромолекулами различной архитектуры. Планируется охарактеризовать состав и физико-химические свойства трехкомпонентных комплексов, а также исследовать уровень и изменение во времени активности ферментов в их составе.С целью выявления гипоксии, а также анализ пота в процессе сна будет проведена апробация (био)сенсорных систем в периодическом и длительном режиме анализа пота в ходе вариабельной физической нагрузки испытуемых различного пола и возраста. Будет разработан компактный электрохимический анализатор на основе коммерческих плат с микроконтроллерами и элементами расширения, совместимых с (био)сенсорами. Будет разработан автоматический электрохимический анализатор глюкозы и лактата с высокоэффективными биосенсорами на основе берлинской лазури С использованием метода биолюминесцентной АТФ-метрии будут проведены работы по оптимизации основных стадий производства БЦЖ вакцины, в частности - стадии лиофилизации. Будут разработаны критерии оценки качества финального продукта по содержанию внутриклеточного АТФ в полупродукте – жидкой БЦЖ вакцине. Будут сконструированы биолюминесцентные репортеры на основе гибридных белков, включающих люциферазу светляков и домены белков-ингибиторов фактора транскрипции NF-κB, которые будут использованы для изучения влияния различных эффекторов на функционирование клеток млекопитающих. Будут сконструированы системы на основе люциферазы светляков для изучения клеточного стресса прокариотических клеток методом биолюминесцентного имиджинга. Изучение прямого окисления металлов ферментами, синергичности одновременного влияния на лизис различных эффекторов: расширение набора исследуемых соединений, в том числе изучение эффектов различных ПАВ. Будут отработаны методики получения иммобилизованных бактериолитических ферментов и кинетическое описание их функционирования при лизисе клеточных субстратов. Создание ферментных комплексов для эффективного превращения свекловичного жома (целлюлозо- и гемицеллюлозо-содержащий отход сахарной промышленности) в С5, С6 сахара простые сахара. Выявить закономерности ферментативной деструкции свекловичного жома в С5, С6 сахара. Изучить состав и свойтва мультиферментных препаратов для превращения свекловичного жома в С5, С6 сахара. Оптимизация технологических аспектов получения летучих жирных кислот и этанола из биомассы в анаэробных условиях Будет разработан метод амплификации сигнала в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот с использованием наночастиц золота. Будут выявлены механизмы про- и антикоагулянтного действия катионных и анионных РАМАМ дендримеров низкой генерации на структуру и функции ключевых компонентов системы коагуляции. Будет выяснена роль С-терминального лизина в молекуле IgG, частично деградированного плазмином, в развитии онкологических заболеваний, что может послужить основой для разработки тест-системы на данные патологии. Выявление наиболее оптимальных способов регуляция активности системы фибринолиза для терапии различных заболеваний и осложнений (кровотечений, метастазирования опухолей и тромбозов). Исследование включения муцина в микрокристаллы ватерита для стабилизации частиц и капсулирования биологически активных веществ (инсулина, апротинина, доксорубицина). Изучение сохранения активности ферментов на примере каталазы при включении в микросферы ватерита. Провести оптимизацию условий синтеза наноразмерных частиц серебра. Исследовать процессы усиления сигнала ГКР при агрегации наноразмерных частиц серебра и золота. Исследовать возможности определения бактерий, вирусных частиц и продуктов ферментативных превращений с использованием спектроскопии ГКР. Создание сенсорных покрытий для электрохимических систем на основе фермент-полиэлектролитных комплексов. Разработка условий получения кальций-фосфатных частиц, покрытых хитозаном, для включения в них ингибиторов АПФ. Характеристика физико-химических свойств частиц, эффективности включения ингибиторов. Определение эффективности частиц, содержащих ингибитор АПФ, для снижения внутриглазного давления и снижения проявлений воспаления при ожогах. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов с внутренним тушением флуоресценции (FRET-субстратов) под действием трех форм АПФ человека. Определение механизма совместного функционирования активных центров в реакции гидролиза FRET-субстратов под действием двудоменного АПФ человека. Разработка непрямого метода определения активности карбоксилэстеразы (КЭ) в реакциях гидролиза сложноэфирных проформ ингибиторов АПФ. Определение кинетических параметров гидролиза проформ ингибиторов АПФ под действием КЭ. Исследование ингибирования КЭ новыми селективными ингибиторами. Разработка новых наноформуляций на основе нанозимов SOD1 для лечения острой фазы трамы спинного мозга с использованием макрофагов как средств направленной доставки в область воспаления. 1 статья, тезисы -2. Оптимизация метода определения активных форм кислорода в слезной и внутриглазной жидкости глаза с помощью платинового электрода, сравнительная оценка эффективности антиоксидантной терапии при использовании SOD1 в составе полимерных наночастиц с двойным покрытием. 1 статья, тезисы -2. Получение высокоэффективных противомикробных препаратов, содержащих литический фермент, инкапсулированный в кальций-карбонатные частицы, модифицированные полимерами. Оптимизация состава и методик получения наноэмульсий для включения антинеопластиков из класса таксанов с ультранизкой водорастворимостью. Сравнительная оценка цитостатической эффективности на клеточных линиях аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, и на клеточной модели солидной опухоли - мультиклеточных опухолевых сфероидах (МОС). Оптимизация методик получения искусственных экзосом из липидов, входящих в состав природных. Получение и характеризация лекарственных наноформуляций.

В 2019 году продолжены фундаментальные исследования в области физико-химии ферментов, биохимии и биотехнологии. Целью работ является повышение качества выпускаемой продукции и совершенствование процессов производства. Проведенные исследования были направлены на использование ферментов в медицине, фармакологии, пищевой промышленности, в аналитических целях и др. Ряд исследований были выполнены впервые и показали результаты для применения их на практике и в промышленных целях. Основное количество исследований носят фундаментальный характер, однако основные результаты нацелены на практическое использование полученных знаний. Наиболее интересные и практически значимые данные получены в области медицинской диагностики и лечения в офтальмологии и онкологии, фармакологии – производство новых эффективных отечественных лекарственных средств, аналитических целях – создание биосенсоров различной направленности, и в промышленных целях – разработка новых видов возобновляемого растительного сырья, характерного для РФ. Проводится изучение включения муцина в микросферы карбоната кальция и использование этого процесса для капсулирования биологически активных веществ. Разрабатываются методы оптимизации технологических аспектов получения летучих жирных кислот и этанола из биомассы в анаэробных условиях. определены высокоаффинные лиганды для конструирования платформы направленной векторной доставки лекарств в гепатоциты (и иные клетки, экспрессирующие исследуемый рецептор, такие, как клетки гепатоцеллюлярной карциномы) путём рецептор-опосредованного эндоцитоза. Разработаны воспроизводимые электрохимические наноэлектроды для определения концентрации АФК, уровня кислорода. Был разработан принципиально новый режим измерения pH в живых системах. Полученные данные показали, что среда внутри опухоли имеет более низкие значения рН по сравнению с нормальной тканью. Проведено исследование локальных механических свойств клеток под действием различных препаратов воздействующих на цитоскелета.

Проведён структурно-функциональный анализ моно- и мультиферментных систем для решения актуальных проблем науки, технологии, медицины, защиты окружающей среды. Проанализированы и адаптированы подходы к получению иммобилизованных биокатализаторов на основе таких систем. Исследованы возможности применения биокатализаторов в ходе решения приоритетных задач. С использованием компьютерного моделирования путём докинга субстратов к активному центру фермента впервые исследована возможность гидролиза 12 различных фосфорорганических агентов и продуктов их разложения под действием органофосфатгидролазы (OPH) и её генетически модифицированной формы (His6-OPH). Были разработаны воспроизводимые электрохимические наноэлектроды для определения концентрации АФК, уровня кислорода. С помощью разработанных наноэлектродов на отрицательных потенциалах возможно определение уровня кислорода, на положительных потенциалах возможно определение активных форм кислорода при измерениях, проводимых относительно хлорсеребряного электрода. Полученные данные показали, что среда внутри опухоли имеет более низкие значения рН по сравнению с нормальной тканью. При этом уровень кислотности выше в глубоких слоях опухоли, чем в поверхностных. Кроме того, было выявлено, что уровень кислотности в опухоли может отличаться как от опухоли к опухоли, так и внутри одной опухоли в зависимости от конкретной зоны. Таким образом, разработанный электрохимический метод определения pH в заданной точке ткани животного позволяет оценить уровень кислотности в опухоли в режиме реального времени в животном. Разрабатываемые гибридные микросферы ватерита могут быть перспективными для мукозальной доставки низкомолекулярных лекарственных веществ, включая белки, ферменты и противораковые препараты, поскольку биоразлагаемые и биосовместимые микросферы ватерита используются в качестве контейнеров для включения лекарственных веществ различной природы. Проведен анализ результатов производственных испытаний на предприятии фирмы Микроген разработанного нами биолюминесцентного АТФ-метода для оперативного контроля активности противотуберкулезной БЦЖ вакцины. Использованный метод позволил сократить время анализа с 28 суток до 1 часа. Разработаны критерии оценки качества финального лиофилизованного препарата БЦЖ вакцины по содержанию внутриклеточного АТФ в жидкой БЦЖ вакцине. Сконструированы биолюминесцентные системы на основе люциферазы светляков для изучения стрессовых воздействий физической и химической природы на клетки бактерий и млекопитающих. Разработан новый способ амплификации аналитического сигнала в гибридизационном анализе ДНК на биочипах с наночастицами золота в качестве метки. В работе исследовали модельные олигонуклеотиды длиной 18 оснований и образцы ДНК бета-лактамаз ТЕМ типа, выделенные из культур бактерий, устойчивых к бета-лактманым антибиотикам. В качестве метки ДНК использовали биотин, который затем выявляли в дуплексах ДНК на поверхности биочипов с использованием конъюгатов стрептавидина с наночастицами золота. Разработанная методика применена для определения генов бета-лактамаз ТЕМ типа, обуславливающих устойчивость бактерий к бета-лактамным антибиотикам. Применение реакции амплификации позволило снизить предел обнаружения в 20 раз, он составил 9.0 пг/мл. Оптимизирована методика выделения бактериолитически активных фракций серотрансферина из плазмы крови человека. Подтверждена чистота препарата. Подобраны оптимальные соотношения компонентов для получения прототипа высокоэффективного антибактериального лекарственного средства для применения в качестве альтернативы антибиотикам в случае антибиотикрезистентности микроорганизмов. Проведено исследование эффектов РАМАМ дендримеров низких генераций (на ключевые компоненты системы гемостаза. Впервые обнаружено, что анионные РАМАМ дендримеры изменяют структуру нативного плазминогена, что приводит к ингибированию скорости его активации эндогенными активаторами. РАМАМ дендримеры различной генерации являются перспективными носителями лекарств, биомакромолекул и в МРТ-диагностике в качестве контрастирующего агента. Разработаны микрокапсулы с регулированной скоростью высвобождения стрептокиназы (активатора плазминогена непрямого действия). Применение этой формы стрептокиназы может повысить эффективность тромболитической терапии благодаря пролонгированию действия и снижению побочных эффектов. Впервые обнаружено увеличение концентрации продуктов деградации IgG в крови пациентов с раком простаты. Результаты могут быть использованы для разработки диагностикума для выявления рака предстательной железы на ранней стадии. Полученны двухслойные полимер-ферментные пленки и охарактеризованы методом пьезоэлектрического микровзвешивания, электрокинетического анализа, атомно силовой микроскопии. Аналитические характеристики полученных ферментных биосенсоров были изучены методами электрохимии. Подобраны оптимальные мультиферментные смеси, включающие эти ферменты, а также дополнительно эндо- или экзо-арабиназы, эндо-галактаназу, β-ксилозидазу, эндо-ксиланазу и/или α-арабинофуранозидазу, которые обеспечивали степень гидролиза СЖ (по выходу восстанавливающих сахаров) 61-68%, по выходу арабинозы – 94%, глюкозы 63-79%. Мультиферментная композиция, состоящая из сухих ферментных препаратов целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ, полученных на основе штаммов грибов Penicillium canescens, P.verruculosum и Aspergillus foetidus, обеспечивала степень гидролиза СЖ по арабинозе и глюкозе близкой к 100% Оптимизирован процесс получения максимального количества летучих жирных кислот (ЛЖК) и этанола на наиболее перспективных образцах биомассы (пшеничная солома и мискантус) модифицированным биокатализатором при подобранной высокой концентрации субстратов и температуры проведения процесса биоконверсии с последующей этерифицикацией их в суперкритическом этаноле. Эти результаты можно напрямую использовать при организации полупромышленного производства ЛЖК и этанола для нужд промышленности из отходов агропромышленного комплекса (АПК) и другого возобновляемого сырья. Проведена характеристика ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) в тканях предстательной железы у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы и раком предстательной железы с использованием комплексного подхода - фенотипирования АПФ. Разработан высокочувствительный метод определения содержания активной формы ингибитора АПФ – эналаприлата по остаточной активности фермента с пределом обнаружения 0,1 нМ. Разработан новый непрямой метод определения активности карбоксилэстеразы с использованием фармакологически важного субстрата – эналаприла (проформа ингибитора АПФ). Проведён анализ литературных данных по современному состоянию в области иммобилизации ферментов и клеток микроорганизмов в полимерные носители, получаемые при криогенной обработке. Выявлены ключевые факторы, влияющие на эффективность получения таких биокатализаторов и их дальнейшего функционирования в различных биотехнологических процессах (в том числе, биомедицине, нанотехнологиях, биосенсорах, охране окружающей среды и т.д.). Определены основные направления для дальнейшего развития в данной области, и сформулированы стратегии для улучшения уже существующих (мульти)ферментных и клеточных систем.