ИСТИНА

Метилирование ДНК по CpG-участкам играет важную роль в регуляции экспрессии генов, дифференциации клеток, геномном импринтинге и других клеточных процессах. ДНК-метилтрансфераза (МТаза) Dnmt3a является одним из главных ферментов, устанавливающим «рисунок» метилирования ДНК в клетках эукариот. Разработан новый метод определения активности МТазы мыши Dnmt3a in vitro c использованием недавно охарактеризованных [1] метилзависимых (МЗ) эндо-нуклеаз рестрикции, специфически расщепляющих метилированную ДНК. Суть метода состоит в последовательном проведении реакций метилирования МТазой Dnmt3a и расщепления МЗ-эндонуклеазами специально сконструированных ДНК-субстратов с последующим анализом продуктов расщепления в денатурирующем полиакриламидном геле по флуоресцентной метке. Были изучены МЗ-эндонуклеазы KroI и PcsI, а также для сравнения и контроля традиционная эндонуклеаза Hin6I, которая не расщепляет метилированную ДНК. Наиболее перспективной оказалась МЗ-эндонуклеаза PcsI, которая в своем участке узнавания содержит две последовательности CpG, разделенные семью парами нуклеотидов, что примерно соответствует расстоянию между активными центрами в каталитически активном тетрамере Dnmt3a. Был создан ДНК-субстрат для тестирования активности Dnmt3a с двумя CpG на указанном расстоянии. В обе последовательности CpG предварительно ввели по одной метильной группе в противоположные цепи в соответствии с необходимым для метилирования расположением цитозинов-мишеней в комплексе Dnmt3a с ДНК. МЗ-эндонуклеаза KroI может иметь лишь ограниченное применение для определения активности Dnmt3a ввиду неполного расщепления метилированного субстрата. В отличие от традиционных методов определения активности МТаз, основанных на использовании радиоактивно меченного S-аденозил-L-метионина, данный метод является надежным, простым в исполнении и недорогим. В перспективе имеется принципиальная возможность одновременного использования МТазы и эндонуклеазы, что может быть осуществлено в ходе дальнейшей оптимизации метода.