Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколенияНИР

Structural and functional analysis of proteins, nucleic acids and protein-nucleic acid complexes as the basis for creating synthetic regulators of gene expression and drugs of new generation

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-1 января 2016 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа: а) Для изучения механизма 3’-концевого процессинга теломеразной РНК человека использовали бицистронные конструкции и установили, что процессинг зависит от промоторной области. Выявлен один достоверно определяемый партнер белка hTERP – убиквитин. б) Проведен скрининг библиотеки соединений, предоставленных компанией Интербиоскрин. Найдены несколько соединений, ингибирующих биосинтез белка у прокариот. в) Показано, что клеточный белок Ku70 защищает интегразу (ИН) ВИЧ-1 от протеасомной деградации, причем стабилизирующий эффект на ИН обеспечивается N-концевой частью (остатки 1-250) Ku70. На модельной системе клеток HEK 293Т, трансфицированных плазмидой с геном ИН было показано, что введение siРНК, подавляющих экспрессию Ku70, снижало количество ИН примерно на 40%. г) На основе известных аптамеров предложена серия потенциальных ДНК-аптамеров к гемагглютинину, полученная модификацией структуры уже известных ДНК-аптамеров на основе предположений о возможных последовательностях узнающих петель. Для новой серии аптамеров изучены топология и термическая стабильность. Апробированы методики определения функциональной активности и аффинности ДНК-аптамеров к гемагглютинину, наилучшей чувствительностью обладает методика ИФА. д) С помощью разрабатываемых нами ненуклеотидных ингибиторов фермента – димерных бисбензимидазолов - удалось осуществить реактивацию нескольких генов-супрессоров опухолей, также определена роль повреждения CpG-сайтов при применении противоракового препарата 6-тиогуанина на метилирование ДНК ферментом Dnmt3a. е) Для дифференциальной оценки ферментативной активности дипептидилпептидазы (ДПП)4 в составе сложного ферментного комплекса, разработаны и синтезированы новые ингибиторы на основе структурных аналогов Pro, с общей формулой X-A-Y, где X = H, Ile, Ala, D-Ala; A = Pro, Ile; Y = Pyr (пирролидин), Рyraz (пиразол), NMP (N-метилпиперазин), Pip (пиперидин), Mf (морфолин). Показано, что синтезированные соединения не ингибируют цистеиновые пептидазы, слабо влияют на химотрипсиновые, оказывая наибольшее действие на ПСП, причем наилучший ингибирующий эффект достигается для ДПП 4. ж) Исследовано действие новых гибридных биоорганических соединений (иммобилизованных на наноалмазах протеиназ и ингибиторов) in vitro на культуру клеток HeLa, условия проникновения этих соединений в клетку, а также взаимодействие с клеточными структурами с помощью разных микроскопических методов. з) В рамках изучения молекулярных механизмов регуляции трансляции методом молекулярной динамики(МД)изучены комплексы бактериальных рибосом со стоп-пептидами из лидирующей последовательности метилтрансфераз семейства Erm, выделены основные кластеры контактов пептида с элементами РТ. Серия полученных ранее пептидных аналогов противопухолевого соединения харрингтонина, была испытана на связывание с 50S и 70S рибосомами E. coli, и показано, что пептидные производные цефалотаксина не связываются с бактериальными рибосомами. Для дальнейших исследований разработан синтез флуоресцентных аналогов харрингтонина. и) Изучено влияние 11S регулятора на кинетические параметры гидролиза 20S и 26S протеасомой типичных флуоресцентных пептидных субстратов. Показано, что 11S субчастица слабо меняет параметры связывания субстратов, но существенно влияет на скорость гидролиза протеасомой. к) Была исследована синтетическая активность РРазы E.coli в присутствии белковых партнеров; заметного влияния не обнаружено. Выявлено, что ион Zn2+, не изменяя каталитических параметров фермента KduI, стабилизирует его гексамерную форму. Высказано предположение о существовании в Mt-РРазе аллостерического центра связывания эффекторов, отличного от РРаз E. coli и эукариот; предложен ряд соединений, которые могут быть тестированы экспериментально как возможные ингибиторы этого фермента.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа: а) Начат поиск факторов процессинга теломеразной РНК человека. Использование репортерных конструкций позволило обнаружить, что в первичном разрезании транскрипта теломеразной РНК принимает участие Интегратор – мультисубъединичный комплекс – регулятор активности РНК-полимеразы II. В процессе определения функциональной роли белка hTERP, кодируемого теломеразной РНК человека обнаружено, что мутации в последовательности hTERP влияют на эффективность активации аутофагии. б) В ходе работы по исследованию активных молекул-ингибиторов трансляции при помощи анализа места остановки рибосомы при ингибировании биосинтеза белка в системе in vitro был изучен механизм подавления белкового синтеза молекулами-хитами, обнаруженными на предыдущей стадии. Проведен отбор мутантных бактериальных штаммов, обладающих устойчивостью к найденным антибактериальным препаратам. В результате скрининга обнаружены новые потенциальные антибиотики, нарушающие синтез белка в клетки или вызывающие СОС-ответ. в) Выполнен поиск аминокислотных последовательностей, гомологичных последовательности rsMutL в базе данных UniProt (анализ более 400 последовательностей). На основе выявленной гомологии выделены домены и участки связывания лигандов в белке rsMutL. Созданы три плазмидные конструкции, несущие ген rsMutL. Использование штамма BL21(DE3)pLysS E. coli позволило уменьшить скорость синтеза и количество rsMutL в клетке и увеличить его растворимость. Активность белка тестировали по его способности вносить одноцепочечный разрыв в специально сконструированную плазмиду, содержащую «мисматч» G/T. Фермент наиболее эффективно гидролизует плазмидную ДНК в присутствии ионов Mn2+. Ионы Zn2+ практически не стимулируют эндонуклеазную функцию rsMutL, что позволяет предположить их важность для стабилизации структуры белка. Синтезированы линейные протяжённые ДНК-субстраты, содержащие и не содержащие разрыв в одной из цепей, для исследования специфичности действия rsMutL, а также дуплексы с пиридилдисульфидной группировкой для последующего селективного кросслинкинга мутантных форм белков rsMutS и rsMutL. г) ДНК-аптамеры к гемагглютинину вируса гриппа, содержащие неканоническую структуру, i-мотив, - интересный пример молекулярного узнающего элемента, активность которого регулируется изменением рН. В 2017 г. была изучена серия гомологичных аптамеров, где структура i-мотива была сохранена, но были изменены соединительные петли. Показано, что петли определяют рН-стабильность и могут влиять на термическую стабильность i-мотива. Было выдвинуто предположение, что цитозин-содержащие петли выступают "воротами", сохраняющими протоны внутри структуры i-мотива, что повышает его рН-стабильность. Также были исследованы модификации аптамера, не содержащие дуплексный элемент на концах олигонуклеотида. Показано, что дуплексный элемент отвечает за сборку мономолекулярной структуры, а также ухудшает рН-стабильность аптамера д) Начат функциональный анализ мутантных форм ДНК-метилтрансферазы DNMT3a человека, найденных при онкологических заболеваниях крови. Получен in vitro ряд мутантных форм каталитического домена этого фермента с аминокислотными заменами, аналогичными найденным у больных. Разработан метод быстрого предварительного определения их метилирующей активности. е) Исходя из структуры проламинов (ПА), ферментами их расщепляющими могут являться глутамил- и пролилрасщепляющие пептидазы (ГРП и ПРП соответственно),но поиск таких ферментов весьма затруднен. Основной причиной является отсутствие надежных и чувствительных соединений, пригодных для скрининга и обнаружения ГРП и ПРП. Нами проведен дизайн и осуществлен синтез высокоселективных хромогенных п-нитроанилидных (рNA) и флуорогенных 4-амино-7-метилкумаридных (АМС) и β-нафтиламидных (βNA) ди- и трипептидных субстратов общей формулы A-Xaa-Yaa-B, где A = Glp, Z, HBr; X = Ala, Ala-Ala, Pro, Phe, Val; Yaa = Pro, Gln; B = AMC, βNA, а также FRET-пептидов общей формулы Abz-X-Pro-Y-pNA, где Х = Leu, Ala, Pro; Y = Leu, Phe, Pro. Структура целевых соединений подтверждена данными ТСХ, масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии, аминокислотного анализа. Синтезированные соединения были успешно использованы для детекции ферментативной активности ГРП и ПРП различного происхождения в индивидуальном состоянии, а также в составе сложных ферментных комплексов (для скрининга различных типов ПРП в грибах-фитопатогенах рода Fusarium, изучения локализации ГРП и ПРП в составе ферментного комплекса насекомых семейства тенебрионид). ж) За отчетный период были получены конъюгаты наноалмазов с трипсином, химотрипсином, субтилизином, папаином, ингибитором трипсина из сои, пероксидазы обладающие ферментативной и ингибиторной активностью. Соединения охарактеризованы с помощью аминокислотного анализа и ИК-спектрометрии. Исследованы энзиматические и ингибиторные свойства конъюгатов с химотрипсином, папаином и соевым ингибитором трипсина. С помощью конфокального и электронного микроскопов проведены исследования по взаимодействию полученных конъюгатов с клетками HeLa. Впервые получен рекомбинантный ингибитор РС камчатского краба, изучены его свойства. з) В рамках изучения молекулярных механизмов регуляции трансляции методом молекулярной динамики изучены комплексы бактериальных рибосом с аминокислотными аналогами антибиотика тилозина. Расчеты проведены с использованием системы, сконструированной на основе кристаллической структуры комплекса рибосомы E. сoli 4V7U, полученной методом рентгеноструктурного анализа. С использованием комбинации метадинамики и равновесной молекулярной динамики найдена конформация пептидного заместителя производного тилозина (у которого в положении 20 находится остаток этилового эфира 2‒имино(окси)ацетилфенилаланина), которая стабилизируется прочными невалентными взаимодействиями, благоприятствуя стабильному связыванию, что позволяет объяснить высокую биологическую активность этого аналога. Кроме того, в тестах in vitro определены ингибирующее действие на трансляцию и способность к связыванию с бактериальными рибосомами серии синтетических трифенилфосфониевых аналогов хлорамфеникола, структура которых отличается длиной алкильного линкера между остатками хлорамфениколамина и трифенилфосфония. Показано, что все аналоги связываются с бактериальными рибосомами E.coli с высоким сродством, а в двойной репортёрной системе RFP/Katushka2S (pDualrep2) ингибируют трансляцию. и) Спектральными и масс-спектрометрическими методами охарактеризованы флуорогенные полиглутамин-содержащие пептиды с 5 и 10 остатками глутамина подряд, содержащие FRET-пару EDANS (флуорофор) и Dabcyl (тушитель). Проверена возможность их гидролиза 20S протеасомой. Определены кинетические параметры для этих веществ. Показано, что наличие глицина в составе субстрата значительно ухудшает как растворимость, так и эффективность гидролиза протеасомой. В ходе изучения гидролиза таких модифицированных пептидов было выяснено, что протеасома способна их гидролизовать и определено место протеолиза. к) На прошлых этапах была разработана стратегия поиска регуляторов РРазной активности, позволяющая тестировать до 40 соединений в одном микропланшете. С использованием этого подхода исследовано влияние на Mt-РРазу большого числа клеточных метаболитов, которые являются субстратами и/или регуляторами ее белковых партнеров. Также предсказано положение аллостерического центра связывания в Mt-РРазе, предложены возможные регуляторы, связывающиеся в этом центре, и начато их экспериментальное тестирование. Обнаружено регуляторное действие на Mt-РРазу следующих соединений: малат; фруктозо-1-фосфат; замещенный аминофосфонат APH1, содержащий гидразиновую группировку; замещенный бисфосфонат BPH17, содержащий дихлорфенильные заместители. Было проведено тестирование нативной и Se-Met FbaB в качестве объектов серийной кристаллографии и показано, что полученные кристаллы не дают достаточной дифракции.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа: а) Выявлено, что белок TERP защищает клетки от апоптоза, активирует механизмы пролиферации клеток на уровне биосинтеза белка. Мутации белка TERP приводят к активации аутофагии. Интегратор координирует процессы инициации и терминации транскрипции теломеразной РНК человека. Подавление активности Интегратора в клетках приводит к накоплению непроцессированной формы теломеразной РНК человека; б) Было проанализировано 500 природных образцов культуральных жидкостей почвенных бактерий и 1000 синтезированных образцов на антибактериальную активность и механизм действия при помощи системы pDualrep2. Проведено выделение активного компонента из культуральной жидкости бактерии рода amycolotopsis. Обнаружен новый ингибитор синтеза белка - тетрациномицин Х. Показано, что новый тиазол-оксазо-модифицированный пептид РОР5 нарушает синтез белка; в) Проверено влияние наличия G-квадруплексов на функционирование белков начальных стадий системы MMR. Сконструированы линейные ДНК, содержащие мотив (GGGT)4, формирующий внутримолекулярный параллельный G квадруплекс, а также GT-«мисматч» для специфического связывания белком MutS и монометилированный участок узнавания эндонуклеазы MutH. Образование G-квадруплекса было подтверждено методом «футпринтинга» и ЯМР-спектроскопии. Впервые продемонстрировано и охарактеризовано связывание белков MutS из E. coli и R. sphaeroides с внутримолекулярными G4-ДНК. Показано, что сродство MutS к G4-ДНК значительно превышает сродство к другим ДНК-лигандам в присутствии АТФ и особенно АТФγS. Установлено, что наличие G4-мотива не ингибирует гидролиз ДНК-дуплекса белками MutH из E. coli и MutL из R. sphaeroides; г) Изучена серия структур комплексов НК-аптамеров с тромбином. НК-аптамеры обладали разными типами каркаса и разными узнающими петлями. Проведен поиск корреляции структура-аффинность. Показано, что аффинность не зависит от структурных параметров комплекса аптамер-белок. На примере G-квадруплексного аптамера к гемагглютинину показано, что замена одних узнающих петель на другие возможна и не приводит к полной потере функции; д) Показано, что димерные бисбензимидазолы DBP(n), содержащие пиперазиновый цикл в олигометиленовом линкере, деметилируют промоторные участки генов-супрессоров опухолей RARB и PTEN в клетках рака молочной железы MCF7. Установлено, что DBP(n) способствуют реэкспрессии генов RARB, PTEN,CDKN2A, RUNX3, Apaf-1 и APC, «молчащих» в клетках MCF7 из-за гиперметилирования промоторных областей. Обнаружено, что деметилирование ДНК в ядре сопровождается увеличением метилирования генов рибосомных РНК в ядрышке раковых клеток; е) впервые выделена и охарактеризована рекомбинантная ИН ВИЧ-1 нового генетического варианта CRF63_02A1, распространяющегося на территории Сибири. Проведен дизайн консенсусной последовательности, получен рекомбинантный препарат интегразы и охарактеризована ее ДНК-связывающая и каталитическая активность. Стабильность комплекса интегразы CRF63_02A1 с ДНК-субстратом не отличается от комплексов интеграз субтипов А и В, однако скорость его образования существенно выше. Более высокими оказались скорости и эффективности реакций, катализируемых интегразой: 3’-процессинга и переноса цепи. Это может быть связано с характерными для интегразы CRF63_02A1 аминокислотными заменами в N-концевом домене, играющем важную роль в мультимеризации фермента и его связывании с ДНК-субстратом ж) Выявлено, что наиболее активной пептидазой, способной осуществлять гидролиз глиадинов по остаткам Gln является цистеиновая эндопептидаза катепсин L, а наиболее активной пептидазой, способной расщеплять глиадины по связям, образованным остатком Pro, является пролин-специфичная дипептидилпептидаза 4 (ДПП4). Синтезированы и охарактеризованы специфические ингибиторы ДПП4, аналоги дипептидов X-Pro, содержащие С-концевые остатки гетероциклических аминов – пиперидина (Pip) и морфолина (Mf). Показано, что синтезированные соединения ингибировали ДПП4 T.molitor лучше коммерчески доступных дипротинов А и Б; з) Получены генетические конструкции для внутри- и внеклеточной экспрессии серпина камчатского краба с различными лидерными последовательностями в системе Pichia pastoris, разработан оригинальный метод эффективного отбора клонов с максимальным уровнем экспрессии; и) Изучены комплексы бактериальных рибосом с антибиотиками и их аналогами расчетными и экспериментальными методами. Методом молекулярной динамики изучены комплексы бактериальных рибосом с хлорамфениколом в присутствии А- и Р-тРНК. Обнаружен возможный, альтернативный общепринятому, сайт связывания антибиотика на рибосоме, существование которого может объяснить экспериментальные данные по неполному ингибированию биосинтеза пептидных последовательностей в присутствии хлорамфеникола. Осуществлен синтез трифенилфосфониевых аналогов хлорамфеникола с удлиненным линкером между трифенилфосфонивоей и амфеникольной частью молекулы. Обнаружена антибактериальная активность трифенилфосфониевых аналогов хлорамфеникола, содержащих в структуре линкеры различной длины, в отношении грам-положительных (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Mycobacterium sp.), и в меньшей степени, грамотрицательных бактерий E. coli. В совокупности с ранее полученными данными по связыванию этих соединений с бактериальными рибосомами и по ингибированию трансляции ин витро это позволяет расценивать трифенилфосфониевые аналоги как перспективные для изучения тонких молекулярных механизмов функционирования рибосомы; к) Подтверждена возможность экспрессии нативного и мутантного хантингтина, содержащего якорные группы, в клетках линии НЕК, проведены попытки выделения и очистки рекомбинантного нативного и мутантного хантингтина человека с помощью комбинации хроматографических методов; л) Путем виртуального скрининга с последующим экспериментальным тестированием были найдены пять новых аллостерических эффекторов Mt-РРазы, включая синтетические аналоги субстрата и природные метаболиты (АТР и малат). Получен и охарактеризован мутантный вариант Mt-РРазы R14Q, а также химерная Mt-РРаза со вставкой N-концевого фрагмента цепи, располагающегося во внутритримерном интерфейсе. Сравнительный анализ каталитических свойств тримерных и гексамерных форм этих ферментов и их взаимодействия с аллостерическими эффекторами показывает, что межсубъединичные интерфейсы и остаток R14 вовлечены в пути передачи информации от аллостерических центров к активным центрам.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа:
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа:
6 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа:
7 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Структурно-функциональный анализ белков, нуклеиновых кислот и белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".