ИСТИНА

Тип Porifera, или губки – одна из наиболее эволюционно древних групп многоклеточных животных. Губки отличаются уникальной пластичностью тканей, демонстрируя широкие способности к возобновлению тканей, перестройке внутренних структур и регенерации. Основой для этих процессов служит активная пролиферация клеток. Предыдущие исследования показали, что основной фракцией пролиферирующих клеток губок являются пищедобывающие клетки, хоаноциты. Тем не менее, динамика пролиферации хоаноцитов долгое время оставалась дискуссионным вопросом. Целью данной работы была разработка метода для описания характеристик клеточного цикла хоаноцитов беломорских губок Halisarca dujardinii (Demospongiae) и Leucosolenia corallorrhiza (Calcarea). Основой метода послужила математическая модель Сандерса, использующая оценку пролиферирующего пула (всей совокупности пролиферирующих клеток) и скорость вхождения клеток в S-фазу для расчета точной длительности клеточного цикла. Оценка пролиферирующего пула хоаноцитов была получена через синхронизацию клеток в S-фазе клеточного цикла с помощью обратимого ингибитора ДНК-полимеразы, афидиколина. Синхронизированные клетки выявляли с помощью инкубации в меченых нуклеотидах EdU. Пролиферирующий пул составил порядка 40 % от общего числа хоаноцитов у H. dujardinii и 60 % – у L. corallorrhiza. Исследование длительности G2-фазы хоаноцитов было проведено методом анализа динамики включения EdU в митотические клетки, выявляемые антителами к фосфорилированному гистону 3. Хоаноциты показали значительную гетерогенность в длине G2- фазы, которая варьировала от 6 до 21 часа; при этом, ориентация митотических веретен указывала на симметричный характер деления хоаноцитов. Скорость вхождения хоаноцитов в S-фазу была исследована с помощью различного времени инкубации в EdU. Доля входящих в S-фазу хоаноцитов за час инкубации составила 0,8 ± 0,3% у H. dujardinii и 0,9 ± 0,1% у L. corallorrhiza. Совместив полученные значения динамики накопления меченых клеток и оценки пролиферирующего пула, мы рассчитали длительность клеточного цикла хоаноцитов у исследуемых губок: 40,3 ± 16,9 ч. у H. dujardinii и 58,7 ± 24,7 ч. у L. corallorrhiza. Для количественного анализа полученных данных был разработан алгоритм полностью автоматического обсчета конфокальных Z-стэков с применением сверточных нейронных сетей на базе Python 3.9. Клеточные ядра были сегментированы с помощью нейронной сети StarDist3D, предназначенной для трехмерной сегментации близко расположенных объектов; это позволило эффективно разделять тесно упакованные ядра хоаноцитов. Для выделения EdU-положительных клеток и хоанодермы были обучены оригинальные нейронные сети типа UNet. Разработанный алгоритм значительно оптимизировал процесс анализаданных с сохранением точности, близкой к ручному обсчету. Работа поддержана грантом РНФ № 23-74-10005.