ИСТИНА

Основной целью проекта является сравнительный анализ механизмов клеточной интеграции в тканях Porifera на примере интегративного исследования интактных тканей и восстановительных процессов. Ключевой задачей проекта является комплексное описание механизмов структурной интеграции (систем цитоскелета, клеточных контактов и их реорганизации), характеристика динамической интеграции (систем возобновления тканей) и сигнальной интеграции (на примере системы контроля активности стволовых клеток), а также попытка проследить функциональную связь между указанными системами как в поддержании гомеостаза интактных тканей, так и ходе восстановления нормальной структуры тканей после повреждений (процессы репаративной регенерации и реагрегации клеток) у губок из удалённых филогенетических групп.

Mechanisms of tissue integration underlie the long-term maintenance of tissue homeostasis in multicellular animals. They determine the behavior of cells and their layers in intact tissues, as well as during normal development and regeneration. The current most important task for researchers is the development of a consistent generalized scheme describing the cellular and molecular mechanisms of cell integration in the tissues of multicellular animals. Such a task cannot be solved without comprehensive studies which, on the one hand, would concern the interaction of various integration mechanisms and, on the other hand, would be conducted on representatives of different Metazoa groups (and not only on model species) to obtain the most complete data for comparative analysis The key objective of this project is a comprehensive analysis of the mechanisms of structural, dynamic and signaling integration and a description of their functional relationship both in maintaining the intact tissues homeostasis as well as during the restoration of normal tissue structure after injury (processes of reparative regeneration and cell reaggregation) in sponges (type Porifera) from distant phylogenetic groups. The novelty of our project is provided by the research objects, the comprehensiveness of methods and approaches, and the comparative aspect of the study. The phylogenetic position and unique body organization make sponges one of the most promising groups for functional studies of the tissue integration mechanisms among the basal metazoans and for the subsequent identification of a set of conservative mechanisms. The comprehensiveness of the project is provided by the study of several tissue integration systems and also concerns our methodological approach: we will combine experimental, anatomical-histological, ultrastructural, molecular-biochemical, and bioinformatic methods and approaches for the most complete analysis of various mechanisms of tissue integration in model sponge species. The comparative aspect of the study is provided by the study of sponges from distant phylogenetic groups and the use of several model systems – intact tissues and restorative processes. Comprehensive comparative studies of sponge tissue integration mechanisms at the level of intact tissues and during recovery processes are not carried out in any laboratory in the world. The successful implementation of the project will provide new fundamental data that will significantly complement modern ideas about the origin and early evolution of multicellularity, the evolutionary development and physiology of animal tissues, as well as about the mechanisms of regeneration. The main genes involved in the integration of sponge tissues will be characterized at the bioinformatic level; expression profiles of these genes will be obtained using comparative transcriptomic analysis, real-time PCR and western blotting; the cellular polarity in intact sponge tissues will be described and its rearrangements during the restoration processes will be analyzed at the morphological and ultrastructural levels; the formation and rearrangements of the actomyosin contractile cable during the reparative regeneration of the calcareous sponge Leucosolenia variabilis will be described and the role of the Rho/ROCK signaling pathway in this process will be evaluated; the cell proliferation in both intact tissues and during restorative processes will be studied in details; the system of somatic stem cell, its regulation mechanisms, and the participation of stem cells in restorative processes will be characterized. The successful implementation of the project is guaranteed by the following: all members of the team have extensive experience of studying sponges (intact animals, their normal development and regeneration); all members of the team have successful experience in collaborative studies using all methods required in the project; our team has at its disposal a wide park of scientific equipment (resource centers of Lomonosov Moscow State University, St. Petersburg State University, IDB RAS) and the possibility of long-term work at the White Sea Biological Station.

В ходе выполнения проекта впервые будет проведено комплексное исследование механизмов интеграции тканей у базальных многоклеточных животных на примере губок. Филогенетическое положение и своеобразие организации делает губок одной из наиболее перспективных групп для подобных исследований. Будут получены данные о структурной, динамической и сигнальной интеграции тканей губок с использованием широкого набора методологических подходов: от прижизненных экспериментов до молекулярно-биохимических и биоинформатических исследований. Полученные результаты также будут важны в сравнительном аспекте, т.к. в проекте будут использованы губки из различных филогенетических линий (Halisarca dujardinii - кл. Demospongiae и Leucosolenia variabilis - кл. Calcarea), а исследования будут проведены не только на интактных тканях модельных видов, но и в ходе их восстановительных процессов. В результате реализации предлагаемого проекта будут получены следующие научные результаты: • в транскриптомах модельных видов губок (H. dujardinii и L. variabilis) будут найдены гены белков-регуляторов цитоскелета, клеточных контактов и полярности; компонентов germline mulipotency program (GMP) и core pluripotency machine (CMP), а также белков, связанных с регуляцией пролиферации и стволового состояния клеток. Будет предсказана их доменная структура и филогенетическое положение; • с помощью методов сравнительной транскриптомики, ПЦР в реальном времени и вестерн блоттинга будут получены данные об изменениях характера экспрессии генов белков-регуляторов цитоскелета, клеточных контактов и клеточной полярности; компонентов germline mulipotency program (GMP) и core pluripotency machine (CMP), а также белков, связанных с регуляцией пролиферации и стволового состояния клеток в ходе восстановительных процессов у модельных видов губок; • на морфологическом и ультраструктурном уровнях будет описана клеточная полярность в эпителио-подобных слоях интактных тканях модельных видов губок, а также проанализировано нарушение (изменение) и восстановление клеточной полярности в ходе восстановительных процессов; • будут описаны формирование и перестройка актомиозинового сократительного тяжа (кабеля) в ходе репаративной регенерации L. variabilis. С помощью функционального ингибиторного анализа элементов и эффекторов сигнального каскада Rho/ROCK будет оценена их роль в восстановительных процессах, в первую очередь в сокращении актомиозинового кабеля в ходе репаративной регенерации L. variabilis; • будет детально описана пролиферативная активность клеток в интактных тканях модельных видов губок: будет оценен пролиферативный пул, получены данные по длине клеточного цикла хоаноцитов, выявлены потенциально покоящиеся/редко пролиферирующие клетки, а также описана миграции и судьба потомков пролиферирующих клеток; • будет детально описана пролиферативная активность клеток в ходе восстановительных процессов у модельных видов губок: будут количественно охарактеризованы изменения в пролиферативной активности клеток, изменения длины клеточного цикла и прослежена судьба потомков пролиферирующих клеток; • с помощью функциональных экспериментов по ингибированию/активации сигнальных каскадов и метода WMISH будет охарактеризована система стволовых клеток губок и механизмы ее регуляции на уровне внутренних программ клеток (генов GMP и CPM) и сигнального контекста (Wnt-каскада); • в ходе восстановительных процессов у модельных видов губок с помощью метода WMISH будет оценена экспрессия генов GMP и CPM, а также прослежено поведение и судьба клеток, которые их экспрессируют.

Все члены коллектива имеют большой опыт работы с губками, как с интактными взрослыми животными, так и с процессами их нормального развития и регенерации (Borisenko et al. 2015, 2021, 2022; Ereskovsky & Lavrov, 2021; Ereskovsky et al., 2015, 2017, 2020, 2021; Lavrov & Ereskovsky 2022; Lavrov & Kosevich 2016, 2018; Lavrov et al. 2018, 2020, 2022; Melnikov et al., 2022; Skorentseva et al., 2022); имеют опыт экспериментальных манипуляций и владеют широким спектром методик фиксации и последующей обработки материала для гистологических, ультраструктурных, иммуноцитохимических (визуализация клеточной пролиферации, апоптоза, систем микрофиламентов и микротрубочек) исследований; имеют опыт работы с различными микроскопами (включая лазерные сканирующие конфокальные микроскопы и электронные микроскопы) и проточными цитофлуориметрами; владеют методами молекулярной биологии (выделение нуклеиновых кислот, ПЦР, ПЦР в реальном времени, гибридизация РНК in situ, вестерн-блоттинг). В группе отработаны методики получения и анализа изображений для различных видов световой и конфокальной микроскопии, а также анализа структур цитоскелета. Также члены коллектива владеют методами биоинформатического анализа, необходимыми для поиска и анализа ортологов необходимых генов в транскриптомных базах данных, и проведения исследований по сравнительной транскриптомике. Все перечисленные выше методы и подходы адаптированы для работы с модельными видами губок. Эти методики успешно применялись в реализации проектов по биологии развития губок. Таким образом, у коллектива имеется надежная теоретическая и методологическая база для углубленного изучения тонких механизмов интеграции клеток в составе тканей модельных видов губок, что дает уверенность в успешной реализации поставленных в Проекте задач.