ИСТИНА

Отчет объемом 105 страниц, 31 рисунок, 10 таблиц, 23 источника, 8 приложений. Ключевые слова: каталитические антитела, ингибиторы, фосфорорганические соединения, ферментативные субстраты. Объектом исследования являются рекомбинантные иммуноглобулины, проявляющие амидазную и эстеразную гидролитическую активность. Целью работы является рациональный дизайн иммуноглобулинов на основе кристаллографических и других данных, полученных на предыдущих этапах, а также разработка общей методики выбора мутаций, необходимых для улучшения каталитических свойств антител. Результаты, полученные в ходе выполнения НИР, должны быть использованы для разработки программы внедрения в образовательный процесс новых лекций и практикумов, базирующихся на результатах, полученных на данном этапе, соответствующих современным мировым стандартам; а также подготовка и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов. Сравнение кристаллических структур интактного и модифицированного антител HabА.17 показало, что основные изменения происходят в пространственном расположении петли третьего гипервариабельного участка тяжелой цепи. Таким образом, проведение мутагенеза аминокислотных остатков этого участка также должно влиять на активность по отношению к фосфорорганическим субстратам. Мутантные формы антитела HabA.17 были созданы методом достройки двух перекрывающихся последовательностей ДНК, полученных методом ПЦР с использованием последовательности HabA17 дикого типа в качестве матрицы. Выход целевого белка варьировался в пределах 60-70%, чистота препаратов мутантных полноразмерных антител составляла 95%. Основываясь на данных, полученных в результате структурного анализа, был проведен рациональный дизайн вариантов мутагенеза абзима с целью детализации особенностей его каталитического механизма. Было предложено провести замену на аланин аминокислотных остатков петли CDR3 тяжелой цепи His-H104 и Asn-H105, участвующих в формировании Н-связи с азотом тропинольного кольца. Также был осуществлен мутагенез 33 и 37 тирозинов легкой цепи антитела с заменой на фенилаланин. Позиции для замены были определены аминокислотными остатками, модифицирующимися фосфонатом Х в реакционных клонах (Y-L33 – во всех клонах, кроме А.17, Y-L37 в клоне А.17), отобранных из библиотеки scFv. В настоящей работе эти мутантные варианты легких цепей А.17 были переклонированы в виде полноразмерных легких и тяжелых цепей для экспрессии в эукариотической системе. Показано, что параоксон связывается с активным центром антитела намного лучше, чем продукт его гидролиза, что может являться объяснением каталитической активности антитела HabA17 по отношению к параоксону. Таким образом, использование молекулярно-динамических методов расчета позволит создать рабочую систему определения эффективности нейтрализации тех или иных ФОТ выбранным антителом. В итоге, используя такой алгоритм действия, можно добиться направленного улучшения антитела-антидота к выбранному фосфорорганическому токсину. За время работы по проекту было получено антитело-антидот HabA17, способное взаимодействовать с рядом фосфорорганических токсинов и, более того, гидролизовать один из них – параоксон. Для данного антитела был получен кристалл и разрешена его трехмерная структура. Для определения того, какие факторы влияют на ковалентное присоединения субстрата ФОТ и какие определяют его гидролитическое расщепление, а также основываясь на данных рентгеноструктурного анализа, была проведена компьютерная симуляция присоединения субстрата ФОТ к антителу и предполагаемого продукта гидролиза ФОТ. Расчет общей энергий взаимодействия является критерием стабильности ковалентного интермедиата. В качестве субстратов были выбраны полностью охарактеризованные ФОТ – арил-фосфонат (OPX) и параоксон (PRX). Анализ результатов компьютерной симуляции показал, что замена остатка Ser35 в легкой цепи антитела HabA17 на положительно заряженную аминокислоту (Lys или Arg) может привести к стабилизации переходного комплекса. Полученное мутантное антитело HabA17 S35R показало существенно более высокое значение эффективности при взаимодействии с параоксоном. Были охарактеризованы физико-химические и каталитические свойства всех полученных мутантных форм. На основании сравнения констант связывания выбраны клоны с лучшими характеристиками для дальнейшего направленного улучшения их свойств. Был осуществлен отбор наилучших клонов в качестве новых биокатализаторов, способных превращать ядовитые фосфорорганические соединения в безопасные вещества. Разработанный подход может быть использован для определения субстратной специфичности антител-антидотов, а также дает возможность рационального дизайна с целью улучшения нейтрализующих свойств антител-антидотов. Таким образом, в ходе выполнения государственного контракта были созданы и внедрены в образовательный процесс следующие лекционные разделы: «Комбинаторная химия пептидов» (4 часа), «Применение приемов комбинаторной химии в области химии нуклеиновых кислот» (6 часов), «Рекомбинантные антитела» (4 часа), «Нанотехнологии в медицине» (10 часов), «Современные методы исследования белков» (2 часа); а также практические занятия «Способы экспрессии полноразмерных антител в клетках млекопитающих» (12 часов). Разработанная система или алгоритм определения эффективности превращения тех или иных субстратов выбранным антителом, могут быть использованы в университетах, институтах, исследовательских центрах и других научно-исследовательских организациях химико-биологического профиля, занимающихся проблемами получения новых биокатализаторов; а также в биотехнологических подразделениях фармацевтических компаний и фирмах-производителях наукоемкой продукции, основным направлением исследований которых является создание, наработка и внедрение препаратов иммуноглобулинов. Разработанные научно-методические пособия могут быть использованы в высших учебных заведениях РФ при чтении курсов лекций для студентов и аспирантов по направлениям: «биоорганическая химия», «биотехнология», «молекулярная биология», «медицинская химия», «химия природных соединений», «биохимия», «иммунология».