ИСТИНА

Отчет объемом 187 страниц, 30 рисунков, 17 таблиц, 26 источников, 6 приложений. Ключевые слова: каталитические антитела, экспрессия в эукариотических системах, ингибиторы, фосфорорганические соединения, флуорогенные субстраты, хромогенные субстраты. Объектом исследования являются клоны-продуценты рекомбинантных иммуноглобулинов, проявляющих амидазную и эстеразную гидролитическую активность. Целью работы является создание клонов трансфектом, стабильно продуцирующих иммуноглобулины человека; оптимизация условий экспрессии клонов в виде полноразмерных антител в эукариотических системах; оптимизация технологии выделения антител; проверка антител на наличие эстеразной, амидазной, протеолитической типов активности, а также на взаимодействие с ингибиторами; разработка научно-методических материалов для специального раздела по рекомбинантным антителам в общий лекционный курс «Иммунология и клеточная биология» и «Нанобиотехнологии в медицине»; разработка научно-методических материалов для практических занятий «Способы экспрессии полноразмерных антител в клетках млекопитающих» студентов и аспирантов высших научно-образовательных учреждений, соответствующих современным мировым стандартам; а также подготовка и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов. На отчетном этапе отработаны подходы для экспрессии и очистки иммуноглобулинов. Генетическими конструкциями, полученными на предыдущем этапе, была проведена ко-трансфекция клеточных линий CHO-К1 и NSObcl2. В результате селекции получены 5 стабильно продуцирующих клонов трансфектом. Уровень продукции рекомбинантных антител оценивался методом иммуноферментного анализа по схеме сэндвич. Для каждого клона были подобраны оптимальные условия экспрессии. Для лучшего клона 2В5 из трансфектом клеток линии СНО-К1, концентрация антител в культуральной среде достигает максимума на 8 день и составляет 10 мг/мл. Для лучшего клона 2G3 из трансфектом клеток линии NSO-bcl2 концентрация человеческих антител в культуральной среде достигает 18 мг/мл на 8 день. Разработана система экспрессии антитела А.17 в препаративных количествах. Оптимальной по соотношению «выход целевого белка ̶ затраты» и чистоте финального продукта была признана экспрессия в культуральных флаконах площадью 225 см2 на бессывороточной среде Pro-CHO4, с уровнем экспрессии 10 мг антитела с литра для клона 2В5 клеточной линии CHO. Отработан метод выделения и очистки антител из культуральной среды. Выход целевого белка оценивался иммуноферментным анализом и составил 70%. Чистоту полученного продукта оценивали с использованием денатурирующего электрофореза в ПААГ, чистота достигает 95%. Анализ реакционной способности показал, что вариабельные фрагменты легких и тяжелых цепей А.17, экспрессированные в составе полноразмерного антитела человека, сохранили способность взаимодействовать с фосфонатом Х. При этом эффективность модификации полноразмерного антитела увеличилась более чем в 10 раз по сравнению с одноцепочечным антителом А.17. Методом MALDI масс-спектрометрии установлено, что ковалентная модификация полноразмерного антитела А.17 фосфонатом Х происходит по тому же пептидному участку легкой цепи иммуноглобулина, что и в случае одноцепочечного антитела. Показано, что полноразмерное антитело сохранило способность взаимодействовать с биотинилированным производным фосфоната Х и субстратную специфичность по отношению к аналогам ФОТ. В обоих случаях модификация фосфонатом Bt-X ингибируется ДФФ, АЭБСФ и параоксоном, тогда как ингибирование отсутствует в случае экотиофата. Модификация антитела А.17 фосфонатом Х ингибируется в присутствии параоксона. Изучено взаимодействие антитела А.17 с параоксоном и показано, что скорость реакции значительно ниже, чем в случае фосфоната Х, линейно зависит от количества добавленного абзима и линейно возрастает с увеличением концентрации добавленного гидроксиламина. Это свидетельствует о том, что реакция А.17 с параоксоном является каталитической и проходит через образование ковалентного интермедиата, причем стадия дефосфорилирования является скорость-лимитирующей для всего процесса. Присутствие ковалентного интермедиата, доказывающее, что гидролиз параоксона антителом проходит по механизму ковалентного катализа, подтверждено методом масс-спектрометрии. Разработаны научно-методические материалы для специального раздела по рекомбинантным антителам в общий лекционный курс «Иммунология и клеточная биология» и «Нанобиотехнологии в медицине»; и научно-методические материалы для практических занятий «Способы экспрессии полноразмерных антител в клетках млекопитающих». Полученные данные, а именно трансфектомы, стабильно продуцирующие иммуноглобулины человека, условия экспрессии антител в эукариотических системах, и технология выделения иммуноглобулинов человека, могут быть использованы в университетах, институтах, исследовательских центрах и других научно-исследовательских организациях химико-биологического профиля, занимающихся проблемами получения новых биокатализаторов; а также в биотехнологических подразделениях фармацевтических компаний и фирмах-производителях наукоемкой продукции, основным направлением исследований которых является создание, наработка и внедрение препаратов иммуноглобулинов. Разработанные научно-методические пособия могут быть использованы в высших учебных заведениях РФ при чтении курсов лекций для студентов и аспирантов по направлениям: «биоорганическая химия», «биотехнология», «молекулярная биология», «медицинская химия», «химия природных соединений», «биохимия», «иммунология».