ИСТИНА

Последние достижения в области биоэнергетики позволили определить основания для процветания ряда микробов в средах с экстремальными показателями солености, щелочности и буферной емкости. Сочетание многочисленных экспериментальных подходов, в том числе, прямого метода визуализации транспорта натрия с помощью радиоизотопного анализа с использованием 22-Na и косвенных методов с использованием эффектов ионофоров и разобщителей, привело нас к решению этой проблемы. С их помощью ранее нами обнаружено у этих микробов функционирование предсказанного нового дыхательного фермента, натрий-перекачивающей цитохромоксидазы, которая устраняет проблему низкого содержания дельта-мю H+, образующегося в жестких щелочных условиях, и эффективно преобразует освобождающуюся энергию в благоприятное значение дельта-мю Na+. Несмотря на четкие доказательства активности такого фермента в микробах, в которых он был обнаружен, механизм его действия был был неизвестен. Мы использовали последние данные генетических экспериментов, филогенетического анализа, рентгенографии и молекулярно-динамических расчетов для решения этой проблемы. В настоящей работе данные о полном опероне натрий-перекачивающей цитохромоксидазы, который мы секвенировали в ходе исследования, и рентгеновский анализ кристаллов высокогомологичной протон-перекачивающей цитохромоксидазы, выполненный группой Х. Михеля (Buschmann et al., 2010), позволили нам реконструировать трехмерную структуру нового фермента. Таким образом, была разрешена загадка контактов аминокислотных остатков 13 альфа-спиралей каталитической субъединицы нового фермента между собой в трехмерном пространстве. Кроме этого, моделирование структуры субъединиц нового фермента позволило в ходе настоящего этапа определить такие важные биохимические свойства субъединиц как pI, что в совокупности с приведенными ниже данными о других структурных особенностях фермента дает ключ к пониманию механизмов адаптации бактерии к условиям обитания, характеризующимся одновременно двумя экстремальными показателями - крайне щелочными рН и близкими к насыщающим концентрациями солей натрия. В ходе выполнения этапа проведена иммунодетекция и идентификация этой Na+-перекачивающей цитохром-с-оксидазы, являющейся продуктом оперона ccoNOQP. С помощью кроличьих поликлональных антител, полученных на предсказанную С-концевую аминокислотную последовательность каталитической субъединицы, показано, что оксидаза cbb3-типа синтезируется в клетках бактерии и локализуется в её мембранах; субъединица оксидазы с мол. массой 48 кДа является каталитической, СcoN; субъединицы с мол. массами 29 и 34 кДа, СcoO и СcoP, соответственно, являются цитохромами с. Определены теоретические значения pI субъединиц СcoN, СcoO и СcoP. Показано, что части субъединиц CcoO и CcoP, экспонированные в водную фазу на P-стороне цитоплазматической мембраны клеток, обогащены отрицательно заряженными аминокислотными остатками, в отличие от граничащих с водной фазой частей интегральной субъединицы CcoN. Сделано заключение, что Na+-перекачивающая цитохром-с-оксидаза T. versutus, как по функции, так и по структуре демонстрирует приспособленность к экстремально щелочным условиям.