ИСТИНА

Отчет за второй этап 2015г по проекту РФФИ № 14-03-00183 1.3. Название Проекта Создание и исследование новых молекулярных переключателей на основе цис- и транс-3(4)-амино-4(3)-гидроксипиперидинов и транс-3,4-диацилоксипиперидинов Форма 503. РАЗВЕРНУТЫЙ НАУЧНЫЙ ОТЧЕТ 3.1. Номер Проекта 14-03-00183 3.2. Название Проекта Создание и исследование новых молекулярных переключателей на основе цис- и транс-3(4)-амино-4(3)-гидроксипиперидинов и транс-3,4-диацилоксипиперидинов. 3,4-положений пиперидинового цикла. 3.3. Коды классификатора, соответствующие содержанию фактически проделанной работы 03-130, 03-110 3.4. Объявленные ранее цели Проекта на 2015 год Синтезировать новые представители транс-3,4-диацилоксипиперидинов с липофильными С3- и С4-заместителями, полученных гидроксилированием С-замещенных пиперидеинов-2. 2.Провести оптимизацию условий получения транс-3-амино-4-гидроксипиперидинов при варьировании полярности растворителей, основности используемых аминов для повышения степени региоселективности 3.Подготовить публикацию по результатам разработки нового способа получения и стереохимии транс-3-амино-4-гидроксипиперидинов. 4. Выполнить тестирование процесса рН-титрования основанием (DBU) D4-метанольного раствора гидрохлоридов полученных 3(4)-амино-4(3)-гидроксипиперидинов с ЯМР-контролем эффективности конформационного переключения. 5. Провести рН-титрование трифторуксусной кислотой с ЯМР-контролем транс-диацилоксипроизводных пиперидина с сильно различающимися полярностями заместителей у атома азота и липофильностью 3.5. Полученные в 2015 году важнейшие результаты Основная задача 2 этапа выполнена : разработан новый регио- и стереоспецифический синтез целевых транс-3-амино-4-гидроксипиперидинов, потенциальных противоопухолевых веществ, что открыло перспективу для продолжения более полных исследований по созданию эффективных универсальных рН-чувствительных конформационных переключателей на основе обоих региоизомеров - транс-3-амино-4-гидрокси- и транс-4-амино-3-гидроксипиперидинов. В соответствии с планом 2 этапа основная задача состояла в развитии короткого и эффективного регио- и стереоспецифичного синтеза транс-3-амино-4-гидроксипиперидинов, которые, с одной стороны, необходимы для исследования в качестве новых рН-чувствительных конформационных переключателей, а, с другой стороны, представляют большой практический интерес как аналоги пиперидиновых псевдодистоминовых алкалоидов, обладающих высокой противоопухолевой активностью с одновременным антагонистическим эффектом к кальмодулину – кальций-связывающему белку, присутствующему в цитоплазме всех эукариотических клеток. ).Схема 1: Высокая биоактивность семейства псевдодистоминов стимулировала интенсивные исследования по установлению их структуры, одновременно поиску стереоселективных и асимметрических путей их синтеза и тестированию видов противоопухолевой активности. Как было нами показано ранее по данным конформационного анализа и квантово-химических расчетов [1] молекула 1-бензил-3,4-эпоксипиперидина находится в конформации полукресла с быстро инвертирующим конформационным равновесием син-конформера и более выгодного анти-конформера с барьером инверсии 1,6 ккал/моль. Схема 2: Поэтому необходимо осуществить полной сдвиг конформационного равновесия в сторону предпочтительного анти-конформера, нуклеофильная атака которого при аминировании, как было показано нами ранее, более вероятна по С-3 пиперидинового цикла эпоксида, что приводит к образованию целевых транс-3-амино-4-гидроксипиперидинов. Эксперименты по конформационному сдвигу равновесия, т.е. конформационному переключению N-нуклеофильной атаки при аминировании эпоксида исследованы в присутствии мягких кислот Льюиса - трифлатов меди (2), серебра, иттербия, титана и других. Другими словами, создана возможность конкурентной атаки N-нуклеофилом и по С-3, и по С-4 пиперидинового цикла. Аминирование эпоксида проводили с варьированием полярности растворителей (хлористый метилен, толуол, тетрагидрофуран, этанол) при различных температурах (20- 45 С) с постоянным хроматографическим мониторингом реакционных смесей. Сравнительный хроматографический контроль реакционной смеси в присутствии кислот Льюиса во всех случаях проводили с использованием реперных 4-амино-3-гидроксипиперидинов и оценкой состава по анализу реакционных смесей по 1Н ЯМР спетрам. Наиболее перспективным оказалось раскрытие эпоксида аминами, в частности пирролидином, в присутствии трифлата иттербия, приводящее к образованию 75% транс-3-(пирролидин-1-ил)амино-4-гидроксипиперидина, в остальных случаях наблюдалось образование практически равного соотношения региоизомеров. Самым удачным было использование в качестве сореагента комплекса диизобутилалюминийгидрида (жесткой кислоты Льюиса) с аминами. Так аминирование 1-бензил-3,4-эпоксипиперидина пирролидином, бензиламином, морфолином и другими аминами протекает быстро, при комнатной температуре с образованием только целевых изомеров - транс-3-амино-4-гидроксипиперидинов, что установлено по данным хроматомасс-спектрометрии и 1Н ЯМР спектров реакционных смесей и индивидуальных соединений и элементного анализа. В качестве примера приведены результаты хроматомасс-спектрального анализа транс-1-бензил-3-(морфолин-1-ил)-4-гидроксипиперидина, 1- хроматограмма с одним пиком с временем выхода 10.59 мин и 2 - масс-спектр с [M+] 276 и масс-спектральная фрагментация соответствуют молекулярной массе и структуре транс-1-бензил-3-(морфолин-1-ил)-4-гидроксипиперидина. 1 2 Также в качестве примера приведены 1Н ЯМР спектры индивидуальных транс- 3-бензиламино-4- гидроксипиперидина (3) и транс- 4-бензиламино-4- гидроксипиперидина (4) с полным отнесением наблюдаемых сигналов к определенным протонам и обоих региоизомеров в реакционной смеси: (3) (4) Отнесение к регио-изомерам транс-3-амино-4-гидрокси- или транс-4-амино-3-гидроксипиперидинам проводили по значениям химических сдвигов и КССВ характеристических протонов при С3 и С4 пиперидинового цикла, например для транс-1-бензил-3-бензиламино-4-гидрокси- (3) и транс-1-бензил-3-гидрокси-4-бензиламинопиперидина (4): х.с., м.д. 3На 4На КССВ, Гц (3) 2.70 3.14 10.1 (4) 3.70 2.55 9.1 Большие значения КССВ 3На,4На, равные 10 и 9 Гц соответственно, свидетельствуют об диэкваториальной ориентации амино- и гидрокси- групп при С3 и С4, т.е. соответствующий изомер (3) является транс-1-бензил-3-бензиламино-4-гидроксипиперидином. Аналогично для всех шести полученных транс-1-бензил-3-амино-4-гидроксипиперидинов проведен конформационный анализ, установлены индивидуальная чистота и стереохимия всех транс-1-бензил-3-амино-4-гидроксипиперидинов. Таким образом, :разработан новый регио- и стереоспецифичный синтез транс-3-амино-4-гидроксипиперидинов, получена серия транс-3-амино-4-гидроксипиперидинов в мягких условиях с высокими выходами -70-80%, которые могут быть потенциальными противоопухолевыми соединениями. Этот результат открывает перспективу для продолжения более углубленных исследований по созданию эффективных универсальных рН-чувствительных молекулярных переключателей на основе обоих региоизомеров - транс-4-амино-3-гидрокси- и транс-3-амино-4-гидроксипиперидинов. Для дигидрохлоридов обоих региоизомеров в CD3OD проведено 1Н (1D)ЯМР- основное (DBU) титрование и показано существование двойного конформационного переключения (Схема 3), дальнейшие исследования будут проведены позднее. 1 2 Двойное переключение при титровании дигидрохлорида DBU проходит сначала при депротонировании атома азота морфолинового цикла (1-е переключение), а затем при депротонировании более основного атома азота пиперидинового цикла. Это первый пример двойного конформационного переключения при изменении рН-среды. Кроме того, для завершения исследований по рН-конформационному переключению (1 этап проекта).синтезированы новые представители транс-3,4-диацилоксипиперидинов с длинными липофильными хвостами при С3- и С4-заместителями и полярным заместителем у атома азота пиперидинового цикла .(Схема 4). Таким образом, заявленные на 2015г задачи выполнены полностью. 3.6. Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем Псевдодистомины A-F имеют структуру 2-замещенных цис-5-амино-4-гидроксипиперидинов, различающиеся абсолютной стереохимией 4-го и 5-го стереогенных центров пиперидинового цикла и химическим строением боковой цепи при С2 . Из этого ряда выделяется псевдодистомин D, который является 2-замещенным транс-4-гидрокси-5-аминопиперидином, обладающим кальмодулинововой антагонистической активностью и сильной цитотоксичностью в отношении клеток [лейкемии мышей и человеческой эпидермальной карциномы КВ [3]. Поэтому развитие регио- и стереоселективного пути синтеза практически полных структурных предшественников псевдодистомина D - транс-3-амино-4-гидрокси- и транс-4-амино-3-гидроксипиперидинов с последующим их тестированием на противоопухолевую активность представляет большую практическую значимость. Сведения в литературе по асимметрическим путям подходов к хиральным нерацемическим аналогам псевдодистоминовых алкалоидов представлены несколькими многостадийными синтезами (от 20 до 30 стадий) [4-8], однако по регио- и стереоселективным методам синтеза их предщественников - транс-4(3)- -3(4)-гидроксипиперидинов сведений мало, однако после нашего сообщения о регио- и стереоспецифичном синтезе транс-1-бензил-4-амино-3-гидроксипиперидинов [1]. появилось несколько публикаций [2,3] также с использованием аминирования син- или анти-конформера 1-бензил-3,4-эпоксипиперидина. Нужно отметить, что в этих сообщениях процесс аминирования с участием анти-конформера эпоксида осуществляли в достаточно жестких условиях, например, при 150ºС и 10-часовом микроволновом облучении, или при нагревании в запаянных ампулах до 80-95оС в полярных растворителях в течение суток. Соотношение образующихся 4- и 3-амино-региоизомеров сильно зависит от природы амина, для первичных аминов изменяется от 1:10 до 1:>20, для вторичных аминов преобладает преимущественное образование транс-3-амино-4-гидроксипиперина.[2,3]. В целом, привлекательность биоактивности псевдодистоминовых алкалоидов стимулирует усилия ученых разрабатывать короткие и эффективные методы асимметрического синтеза и алкалоидов и их аналогов. 1. 1. Веселов И.С., Трушков И.В., Зефиров Н.С., Гришина Г.В// ЖОрх., . 2009. 45. 1062-1072. 2. M. Scheunemann, L. Hennig, Uta Funke, J. Steinbach. // Tetrahedron. 2011. 67. 3448-3456. 3. Osamu Tokuda, Toshiaki Aikawa, Tetsuya Ikemoto, Isao Kurimoto. // Tetrahedron Letters. 2010. 51. 2832–2834. 4. Doi, Y., Ishibashi, M., Kobayashi, J. Total synthesis of pseudodistomin C, a sphingosine-related piperidine alkaloid from tunicate Pseudodistoma kanoko. // Tetrahedron 1996. 52. 4573-4580. 5. Langlois, N. Stereoselective formal synthesis of pseudodistomin C. // Org. Lett. 2002. 4. 185-187. 6. Trost, B., Fandrick, D. DYKAT of vinyl aziridines: total synthesis of (+)-pseudodistomin D. // Org. Lett. 2005. 7. 823-826. 7. Haddad, M., Larcheveque, M., Tong, M. A stereoselective approach to the synthesis of pseudodistomin D. // Tetrahedron Lett. 2005. 46. 6015-6017. 8. Davies, S., Fletcher, M., Lee, J., Roberts, M., Russell, A., Taylor, J., Thomson, A., Thomson, J. Polysubstituted piperidines via iodolactonization: application to the asymmetric synthesis of (+)-pseudodistomin D. // Org. Lett. 2012. 14. 1672-1675 3.7.1. Методы и подходы, использованные в ходе выполнения Проекта Для выполнения исследований использованы современные методы тонкого органического синтеза, очистку и выделение индивидуальных соединений проведены с помощью флеш-хроатографии, колоночной и пластиночной препаративной хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия. Анализ промежуточных и целевых соединений выполнялся методом хромато-масс-спектрометрии, масс-спектрометрии высокого разрешения; конформационный анализ соединений проведен в апротонных и протонных средах с помощью спектроскопии 1Н, 13С ЯМР высокого разрешения с применением разнообразных спектральных методологий.Выполнение поставленных к концу 2015г задач открыло перспективу реализации проекта в целом.) 3.7.2. Вклад каждого члена коллектива в выполнение Проекта в 2015 году 1. Гришина Г.В. – анализ литературных сведений, спектральных данных , обсуждение результатов, общее руководство работой и и написание отчета. 2. Веселов И.С. - выпонение основных экспериментальных работ и анализ данных 1Н, 13 С ЯМР 3. Трушков И.В. – проведение квантово-химических расчетов и общее обсуждение результатов. 4. Алексеев Р.С. - выполнение оптимизации условий основных реакций 5. Юровская М.А. - обсуждение спектральных и экспериментальных результатов. 3.8.1. Количество научных работ по Проекту, опубликованных в 2015 году (цифрами) (пункт заполняется автоматически, выводится количество заполненных 509 форм) 3.8.1.1. Из них в изданиях, включенных в перечень ВАК 3.8.1.2. Из них в изданиях, включенных в библиографическую базу данных РИНЦ 3.8.1.3. Из них в изданиях, включенных в международные системы цитирования (библиографические и реферативные базы научных публикаций) 3.8.2. Количество научных работ, подготовленных в ходе выполнения Проекта и принятых к печати в 2015 году (цифрами) 3.9. Участие в 2015 году в научных мероприятиях по тематике Проекта, 1.Международная конференция IT + M&E, Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, Крым, Гурзуф, 02-12.06.2015, пленарный доклад. 2. International Congress on Heterocyclic Chemistry "KOST-2915" , Мoscow, 18-23.10.2015, устный доклад. 10.1 Заявка на 2016г. Номер Проекта 14-03-00183 10.2.1 Основной код классификатора 03-130 Синтез, строение и свойства природных и физиологически активных веществ; медицинская химия и прогнозирование различных видов биоактивности 10.2.2 Дополнительные коды классификатора 10.3 Ключевые слова (не более 15) псевдодистоминовые алкалоиды, аминоспирты пиперидинового ряда, конформационный анализ, стереохимия, стереоселективный синтез. 10.4 Задачи Проекта, которые должны быть решены в 2016 году, их связь с целью и задачами Проекта (перечислить задачи и указать распределение исполнителей по задачам Проекта на 2016 год) Полученные серии обоих региоизомеров 3(4)-амино-4(3)-гидроксипиперидинов и сведения по их конформационному анализу будут использованы при тестировании этих соединений в качестве конформационных переключателей. !. Будут сформированы пары основание -дигидрохлорид на основе обоих региоизомеров для проведения ЯМР-титрования для оценки эффективности молекулярного переключения в зависимости от структуры 3-амино-4-гидрокси-мзомера и 4-амино-3-гидрокси-изомера. 2. Будет проведена оценка эффективности молекулярного переключения в зависимости от строения и природы аминных заместителей при С3 и С4 пиперидинового цикла. 3. Среди обеих серий региоизомеров транс-бета-3,4-аминоспиртов пиперидинов будут выбраны соединения-лидеры по величине энергий переключения для дальнейших исследований. 4.Будут проведены предварительный скрининг in situ на антиопухолевую активность и оценка в случае удачи их эффективности для пар 3-амино-4-гидрокси- и 4-амино-3-гидрокси-изомеров. 10.5 Ожидаемые в конце 2016 г. научные результаты 1.На основании анализа результатов ЯМР-титрования дигидрохлоридов обоих типов региоизомеров позволят оценить эффективность конформационного переключения в зависимости от структуры 3-амино-4-гидрокси-изомера и 4-амино-3-гидрокси-изомера, от природы аминных заместителей при С3 и С4 пиперидинового цикла. 2. В соответствии с полученными данными по максимальной энергии конформационного переключения в зависимости от типа региоизомера будут выбраны соединения-лидеры для углубленных исследований. по величине энергий переключения для дальнейших исследований. 3. В случае удачи по результатам предварительного скрининга in situ на противоопухолевую активность пар 3-амино-4-гидрокси- и 4-амино-3-гидрокси-изомеров будут выбраны соединения-лидеры. 10.6 Объем финансирования на 2016 г. запрашиваемый в Фонде 800000,00 10.6.1 Перечень оборудования и материалов, которые необходимо дополнительно приобрести, изготовить или отремонтировать для успешного выполнения Проекта; обосновать необходимость его приобретения и указать приблизительную стоимость 1. Для выполнения работы по проекту необходимо приобрести ряд растворителей, включая дейтерированные метанол, толуол, дихлорметан и д.р., отремонтировать химическую посуду, ампулы для 1Н ЯМР -титрования. 10.6.2 Перечень командировок (в том числе зарубежных), необходимых для выполнения проекта. Обосновать их необходимость и указать приблизительную стоимость Планируется командировка в Стоктонский университет, Калифирния, США, для проведения экспериментов по 1Н ЯМР -титрованию с фиксацией рН-среды, стоимость оценить сложно. 10.6.3 Планируемая численность участников Проекта в 2016 году (цифрой)(пункт заполняется автоматически по формам 512, исполнителями Проекта на 2016 год считаются все принявшие приглашение Руководителя проекта) 5 10.7 Полный список членов коллектива на 2016 год (не более 10 человек, указать ФИО и должность; исполнителями Проекта на 2016 год считаются только персоны, принявшие приглашение Руководителя проект; список должен соответствовать списку по формам 512-И) 1. Веселов Иван Сергеевич, кхн. мнс 2. Трушков Игорь Викторович, дхн, внс 3. Алексеев Роман Сергеевич, кхн, мнс 4. Юровская Марина Абрамовна, дхн, внс Подпись руководителя