Аннотация:С появлением технологии CRISPR-Cas9 активно развиваются биомедицинские исследования, использующие специально сконструированные модельные клеточные системы, позволяющие прицельно исследовать функции отдельных молекулярных комплексов и клеточных компонентов, ответственных за развитие заболеваний человека. Ряд тяжёлых патологий (нервные, кожные, мышечные, кардиомиопатии) связан с нарушениями структуры/функций промежуточных филаментов (ПФ). Чтобы понять, каким образом осуществляется взаимодействие цитоскелетных структур, влияют ли микротрубочки и β- и γ-цитоплазматические актины (β-cytA и γ-cytA) на формирование сети виментиновых ПФ, их распределение и взаимодействие с митохондриями, мы получили модельные клеточные линии фибробластов REF52, лишенные β-, либо γ-cytA. Для получения REF52 (β-Act-/-) и REF52 (γ-Act-/-) с нокаутом генов β-cytA и γ-cytA соответственно, были сконструированы плазмиды pSpCas9n(BB)-2A-puro-Act(1+2), кодирующие мутантную форму эндонуклеазы Cas9, способную делать однонитевые разрывы ДНК, ген устойчивости к пуромицину и две молекулы гидовых РНК, комплементарных к близко расположенным разнонаправленным участкам в генах β- или γ-cytA. Трансфекция плазмидами и последующая селекция клеток при помощи пуромицина позволили выделить и охарактеризовать линии, экспрессирующие только одну изоформу. В клетках REF52 (β-Act-/-) γ-cytA формирует характерную кортикальную сеть и актиновые стресс-фибриллы, значительно менее выраженные, чем в клетках REF52 дикого типа. В клетках REF52 (γ-Act-/-) β-cytA формирует актиновые пучки, по количеству и толщине не отличающиеся от клеток REF52. Физиологические характеристики клеток линий REF52 (β-Act-/-) и REF52 (γ-Act-/-) in vitro различаются: они по-разному распластываются на субстрате и в разное время переходят к движению. Клетки, лишенные β-cytA, в два раза быстрее заполняют экспериментальную рану, а лишенные γ-cytA - медленнее, чем REF52. Полученные модели будут использованы для выяснения специфических свойств виментиновых ПФ, их взаимодействия с другими компонентами цитоскелета клетки и митохондриями.
