Переключение экспрессии изоформ субъединицы PHF10 ремоделирующего хроматин комплекса PBAF в процессе дифференцировки клеток кровистатья

Работа с статьей


[1] Переключение экспрессии изоформ субъединицы phf10 ремоделирующего хроматин комплекса pbaf в процессе дифференцировки клеток крови / Г. М. Вирясова, Н. В. Сошникова, Ю. П. Симонов и др. // Успехи молекулярной онкологии. — 2016. — Т. 3, № 4. — С. 36–37. Введение Клетки крови проходят сложный путь развития, от образующихся в костном мозге предшественников до конеч-но дифференцированных клеток, таких как лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и эрит-роциты. Дифференцировка нейтрофилов происходит из гематопоэтических стволовых клеток по миелоидному пути. В ходе дифференцировки происходят изменения в экспрессии генов, которые приводят к значительной специализации клеток и изменению морфологии. При нарушениях и сбоях процессов дифференцировке промие-лоцитов возникает промиелоцитарная лейкемия. Ремоделирующий хроматин комплекс PBAF (SWI/SNF), состо-ящий из 12 субъединиц, является одним из наиболее важных мультибелковых комплексов, контролирующих транскрипцию генов и влияющих на дифференцировку клеток. Предполагается, что именно специфические субъединицы определяют паттерны экспрессирующихся генов в разных типах клеток. Альтернативные субъеди-ницы PBAF комплекса могут являться не только различными белками, но и изоформами одного белка, которые могут быть функционально различными. Задачи исследования Основной целью исследования являлось изучение роли замены субъединиц комплексa PBAF в процессе дифференцировки промиелоцитов человека в нейтрофилы, используя модельную си-стему - раковую линию HL-60, дифференцированные из нее миелоциты и нейтрофилы, выде-ленные из крови здоровых доноров. Материалы и методы В качестве модельной системы в данном исследовании использована клеточная линия HL-60 (ра-ковые промиелоциты человека). Недифференцированные клетки HL-60 экспрессируют маркеры, характерные для пролиферирующих промиелоцитов, при дифференцировке транс-ретиноевой кислотой они дифференцируются в миелоциты и часть клеток приобретает характерные для нейтрофилов свойства — способность к фагоцитозу и спонтанному апоптозу. В клетке изменя-ется содержание специфических маркеров (например, CD66), что позволяет выдвинуть гипотезу и о более глобальных изменениях, связанных в том числе с утерей способности к пролиферации по мере окончательной дифференцировки. Линия HL-60 была использована в качестве клеток-предшественников зрелых нейтрофилов. Таким образом мы исследовали три типа клеток, отли-чающиеся степенью дифференцированности: недифференцированные HL-60, дифференцирован-ные ретиноевой кислотой HL-60 и зрелые нейтрофилы. Нейтрофилы выделяли из цельной крови здоровых доноров непосредственно в день эксперимента. Микроскопия и проточная цитофлуо-риметрия позволили подтвердить морфологические различия и появление известных специфиче-ских маркеров в клетках в ходе дифференцировки. Анализ экспрессии всех субъединиц PBAF комплекса и различных изоформ PHF10 в клеточных линиях HL-60, дифференцированных из нее миелоцитов и нейтрофилов здоровых доноров на уровне РНК проводился с помощью количе-ственной ПЦР. Анализ экспрессии на уровне белка (PHF10, Brg1, Brd7, BAF155, BAF180, BAF200) - компонентов комплекса PBAF в различных клетках будет проводиться методом Ве-стерн-блот анализа. Полуколичественно содержание субъединиц комплекса будет оценено с по-мощью проточной цитофлуориметрии. Субъединичный состав комплекса подтверждали коим-муннопреципитацией с помощью специфических антител к различным изоформам PHF10 и субъединицам PBAF. С помощью хроматин-иммуннопреципитации (ChIP) изучали влияние PBAF комплекса на экспрессию генов, активирующихся на определенных стадиях дифференци-ровки клеток крови, дифференцирующихся по миелоидному пути. Результаты Дифференцировка клеток линии HL-60 проводилась 2 мкМ транс-ретиноевой кислотой. На 3-й и 6-й день наблюдали изменения в структуре ядра при помощи световой микроскопии, наблюдали увеличение экспрессии специфических маркеров CD66 (a и b) и падение экспрессии генов клеточ-ного цикла CyclinD1 и P21, сравнивали с нейтрофилами. Было выявлено, что в ходе дифференци-ровки в ряду HL-60 (недифференцированные) – HL-60 (дифференцированные) – нейтрофилы происходит уменьшение экспрессии субъединиц Brg1 и Baf200, но для некоторых субъединиц, например, Brd7, в ходе дифференцировки напротив происходит увеличение уровня экспрессии. Проанализировали содержание различных изоформ субъединицы PHF10 на разных этапах диф-ференцировки. Субъединица PHF10 имеет 4 изоформы (Pl, Ps, Sl и Ss), отличающиеся наличием или отсутствием N-концевого и PHD доменов. Обнаружили, что в ходе дифференцировки клеток помиелоидному пути происходит замена изоформы PHF10-Pl на PHF10-Ss. Выводы На основании полученных данных можно сделать следующие выводы: 1) При дифференцировке клеток крови по миелоидному пути снижается экспрессия субъединиц PBAF комплекса 2) Происходят качественные изменения состава комплекса как минимум в одной из субъ-единиц: изоформа PHF10-Pl заменяется на изоформу PHF10-Ss.

Публикация в формате сохранить в файл сохранить в файл сохранить в файл сохранить в файл сохранить в файл сохранить в файл скрыть