ИСТИНА

Проект посвящен развитию одного из важнейших направлений современной науки – деградомики и включает использование геномного, транскриптомного и протеомного подходов для структурно-функциональных исследований обширного спектра сериновых пептидаз (CП) из семейства S1А химотрипсина у насекомых-вредителей запасов зерновых Tribolium castaneum и Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae). Впервые будет описан и охарактеризован весь спектр СП этих насекомых, включая активные СП и их неактивные гомологи (ГСП). Спектр пищеварительных СП будет оценен при анализе экспрессии генов кишечных СП насекомых и исследован биохимическими методами с последующей идентификацией MS методами. Анализ экспрессии генов СП и ГСП в процессе онтогенеза T. molitor позволит выявить белки, вовлеченные в процессы онтогенеза, метаморфоза и конститутивно экспрессирующиеся на всех стадиях развития, что может быть использовано для углубления представлений о функциональной роли белков этого семейства как у насекомых, так и у человека. Анализ влияния синонимичной замены серина активного центра на протеолитическую активность рекомбинантного препарата ГСП впервые позволит получить важные данные о возможных путях эволюции сериновых и цистеиновых пептидаз из клана РА. СП с максимальной активностью по отношению к главным пищевым белкам насекомых – глиадинам, будет получена в рекомбинантной форме, очищена, охарактеризована и впоследствии может быть использована для энзимотерапии целиакии и получения безглютеновых продуктов и детского питания. Воздействие специфического ингибитора этой СП на рост и развитие тенебрионид будет тестировано индивидуально и в комбинации с другими ингибиторами и/или энтомоцидными токсинами для последующего использования в качестве биологического инсектицида.

The project is devoted to the development of one of the most important areas of modern science - degradation, and includes the use of genomic, transcriptional and proteomic approaches for structural and functional studies of the wide spectrum of serine peptidases (SP) from the S1A chymotrypsin family in storage product pests Tribolium castaneum and Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae). For the first time, the entire spectrum of SP of these insects, including active SP and their inactive homologs (SPH), will be described and characterized. The spectrum of digestive SP will be evaluated using the analysis of SPs genes expression and examined by biochemical methods followed by identification using MS methods. Analysis of SP and SPH genes expression during T. molitor ontogenesis will allow to identify proteins involved in ontogeny, metamorphosis and constitutively expressed at all stages of development. These data can be used for further understanding of the functional role of proteins from this family in both insects and human. Analysis of the effect of synonymous replacement of the active center serine on the proteolytic activity of the recombinant SPH preparation for the first time will yield important data on possible pathways of the evolution of serine and cysteine peptidases from the RA clan. The SP with the maximum activity towards the main food proteins of insects - gliadins, will be obtained in recombinant form, purified, characterized and subsequently can be used for celiac disease enzyme therapy and production of gluten-free products and baby food. The effect of specific inhibitor of this SP will be tested on the growth and development of tenebronids individually and in combination with other inhibitors and/or entomocidal toxins for subsequent use as a biological insecticide.

1. Будет выявлен набора генов, гомологичных СП из семейства S1, в геноме T. castaneum и проведен анализ спектра активных СП и неактивных ГСП, кодируемых этими генами (доменная организация, аминокислоты активного и субстрат-связывающего центров). При необходимости будет проведена корректировка аннотации генов. 2. Будет осуществлена сборка, аннотация и анализ спектра СП из семейства S1 в полноразмерном транскриптоме кишечника личинок T. molitor. Будет проведено сравнение СП двух видов тенебрионид. Анализ доменной организации позволит выявить секретируемые СП, а также содержащие различные регуляторные домены в пропептиде. Анализ аминокислот активного центра позволит отличить активные СП от неактивных гомологов (ГСП), включая белки с синонимичной заменой Сер→Тре. Анализ остатков субстрат-связывающего центра позволит выявить известные виды СП и предсказать новые, с нестандартной для СП субстратной специфичностью. Анализ филогенетических взаимосвязей СП позволит уточнить классификацию СП, предсказать пути их эволюции. 3. Анализ уровней экспрессии выявленных СП в транскриптомах кишечников личинок T. castaneum и T. molitor позволит: а) оценить состав кишечного спектра СП T. castaneum для точного сравнения именно кишечных последовательностей обоих насекомых; б) оценить спектр СП, имеющих внекишечную локализацию; в) определить набор предположительно пищеварительных СП, обладающих высоким уровнем экспрессии, активность которых может быть выявлена при тестировании в экстракте. 4. Будет разработана методика ускоренной идентификации СП в многокомпонентных смесях с использованием библиотек флуорогенных пептидных субстратов, щадящих электрофоретических методов и масс-спектрометрического анализа. 5. Разработанная методика ускоренной идентификации СП в многокомпонентных смесях позволит провести анализ спектра субстратной специфичности пищеварительных СП в экстрактах кишечников тенебрионид после электрофоретического разделения, выявить наиболее активные СП. 6. Будет проведена идентификация аминокислотных последовательностей наиболее активных СП с использованием масс-спектрометрических методов. Эти данные позволят уточнить основы организации пищеварительного протеолиза в кишечниках тенебрионид, обладающих разнообразным спектром пищеварительных пептидаз.

У авторского коллектива имеется большой опыт работы по изучению пептидаз. Члены коллектива специализируются в различных областях биохимии, молекулярной биологии, биоинформатики, энтомологии. Участники проекта в течение многих лет занимаются изучением пептидаз, входящих в состав пищеварительного комплекса насекомых. Была изучена также организация пищеварительного протеолиза у двух видов малых мучных хрущаков: Tribolium castaneum и Tribolium confusum (Vinokurov et al., 2009. Arch. Insect Biochem. Physiol. 70:254-279).Заявителями впервые был охарактеризован комплекс пищеварительных пролин-специфичных пептидаз насекомого. У личинок T. molitor были найдены тканевая кишечная пролин-специфичная пептидаза, предположительно пролилолигопептидаза, и пищеварительные пролилкарбоксипептидаза, дипептидилпептидаза 4 и пролидаза. Пищеварительные пролин-специфические ферменты были идентифицированы методами MS и охарактеризованы с точки зрения их физико-химических и энзиматических параметров. Была исследована внутриклеточная и тканевая локализация этих пролин-специфичных пептидаз (Гоптарь и др., 2008. Биоорг. химия, 34:310-316; Goptar et al., 2008. Biochimie, 90: 508-514; Goptar et al. 2013. Insect Biochem. Mol. Biol., 43:501-509; Tereshchenkova et al., 2016. Insect Biochem. Mol. Biol., 76:38-48; Tereshchenkova et al., 2017. Arch. Insect Biochem. Physiol. 95(4):e21395). Было показано, что цистеиновые пищеварительные пептидазы обладают постглутамин-расщепляющей активностью (Goptar et al. 2012. Comp. Bioch. Physiol. 161В: 148–154).