Влияние природных осмолитов и температуры на светозависимый перенос зарядов в реакционных центрах пигмент-белковых комплексов фотосистем 1 и 2НИР

Effect of natural osmolytes and temperature on the light-dependent charge transfer in the reaction centers of pigment-protein complexes of photosystems 1 and 2.

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 31 октября 2017 г.-31 декабря 2018 г. 1
Результаты этапа: 1) Влияние ограничения конформационной динамики белкового комплекса на реакции переноса электрона в фотосистеме 1. Важным подходом к выяснению молекулярных механизмов переноса зарядов в белках является изучение кинетики электронного транспорта в условиях ограниченной конформационной подвижности. Традиционным методом ограничения динамики белковых комплексов являются низкотемпературные исследования. В настоящей работе в широком диапазоне от 5 до 300 К была изучена температурная зависимость рекомбинации зарядов в комплексах фотосистемы 1 (ФС 1), не содержащих железо-серных кластеров. При температурах выше 140 К реакции рекомбинации зарядов между хинонными акцепторами А1А и А1В (в симметричных ветвях редокс-кофакторов А и В) и фотоокисленным первичным донором Р700 (P700+A1A−→P700A1A и P700+A1B−→P700A1B) имели энергию активации 22 и 16 мэВ, соответственно, и сопоставимые амплитуды. Ниже 140 К их кинетики не изменялись, а амплитуда медленной компоненты постепенно возрастала, достигая 75% от общей амплитуды ниже 80 K. Наличие зависимости амплитуд кинетических фаз ниже температуры стеклования не может быть объяснено в рамках классической теории переноса электрона. Полученные данные были проанализированы в рамках квантовой модели электрон-фононного сопряжения донора и акцептора электрона. Другим способом ограничения конформационной динамики белков является их высушивание в стекловидной трегалозной матрице. Недавние исследования на бактериальных реакционных центрах и комплексах ФС 1 показали, что кинетика переноса электронов в высушенной трегалозной матрице существенно меняется и становится сходной с кинетикой, наблюдаемой при низкой температуре в растворе. Однако более ранние исследования ФС 1 были сделаны во временном диапазоне >30 микросекунд. В настоящей работе исследования были существенно расширены за счет регистрации более быстрых реакций с временным разрешением 10 наносекунд, а также на комплексах ФС 1, содержащих различное количество железо-серных кластеров, служащих акцепторами электрона. Прямые и обратные реакции переноса электрона были исследованы в образцах комплексов ФС 1, содержащих различное количество терминальных железо-серных кластеров – акцепторов электрона. Объектами исследования стали нативные комплексы из цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 (содержащие кластеры FX, FA и FB), комплексы FX-core из того же организма (содержащие только FX) и комплексы ФС 1 из мутантного штамма rubA, полностью лишенные кластеров FA, FB и FX. С целью выяснения механизма протекторного действия дисахарида трегалозы эти образцы ФС 1 исследовались в растворе и после высушивания в трегалозной стекловидной матрице при относительной влажности 11%. Измерения проводились на длинах волн 480 и 830 нм, что позволило сопоставить данные о прямых и обратных реакциях переноса электрона. Экспериментальные кинетики были проанализированы с помощью программы CONTIN и смоделированы с помощью разработанной кинетической модели переноса электрона в ФС 1. Показано, что высушивание ФС 1 в трегалозной матрице полностью останавливает прямой перенос электрона от филлохинонов А1 к FX в части комплексов и замедляет его асимметричным образом для ветвей А и В в оставшихся комплексах. Для дальнейшего анализа влияния трегалозы на перенос зарядов в ФС 1 была построена молекулярно-динамическая модель ФС 1, погруженной в трегалозную матрицу. 2 Влияние осмолитов на перенос электрона и выделение кислорода на выделенных пигмент-белковых комплексах фотосистемы 2 и в хлоропластах. Светозависимое выделение кислорода при фотосинтезе – основополагающий природный процесс, однако молекулярный механизм разложения воды комплексами фотосистемы 2 (ФС 2) изучен недостаточно детально. Кроме того, комплекс окисления воды (КОВ) ФС 2 является наиболее лабильным участком во всей электрон-транспортной цепи фотосинтезирующих оксигенных организмов. Поэтому изучение влияния осмолитов на КОВ ФС 2 является важной и актуальной проблемой. С помощью импульсной спектрометрии на ядерных комплексах ФС 2 показано, что трегалоза оказывает стабилизирующее действие на КОВ. Поляриметрические и флуориметрические методы продемонстрировали, что трегалоза вдвое стимулирует стационарную скорость выделения кислорода, а также увеличивает относительную долю реакционных центров ФС 2, способных окислять QA–. С помощью прямого электрометрического метода показано, что трегалоза не влияет на кинетику электрогенного переноса электрона от Mn на редокс-активный радикал тирозина Yz• (переход S1→S2), но заметно ускоряет кинетику выброса протонов вблизи марганцевого кластера при S2 → S3 и S4 → S0 переходах КОВ. Была исследована кинетика редокс-переходов первичного донора электрона ФС 2 – димера хлорофилла Р680 в высушенных стекловидных трегалозных матрицах путем регистрации изменений поглощения на длине волны 830 нм. Показано, что, по сравнению с раствором, наблюдается частичное блокирование прямой реакции переноса электрона между тирозином Yz и P680+ (~10 мкс), и появление медленной компоненты с характерными временами 100-150 мкс, вероятно обусловленной обратным переносом электрона от восстановленного первичного хинонного акцептора QA- на P680+. С помощью полярографии и флуорометрии было исследовано влияние влияние другого осмолита - гетероциклической аминокислоты гидроксиэктоина (Ect-OH) - на препараты ФС 2 с активным КОВ и продемонстрировано, что стационарная скорость выделения кислорода в присутствии этого осмолита увеличивается приблизительно на 40%. Показано также, что Ect-OH ускоряет перенос электронов от экзогенных доноров к РЦ в препаратах ядерных комплексов ФС 2, лишенных марганцевого кластера. Предполагается, что Ect-OH может служить для этих препаратов искусственным донором электрона, который не взаимодействует напрямую ни с донорной, ни с акцепторной стороной РЦ. Методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) изучено влияние дисахаридов трегалозы и сахарозы на активность хлоропластов шпината при псевдоциклическом транспорте электронов (Н2О → ФС 2 → ФС 1 → О2). О фотохимической активности хлоропластов судили по кинетике редокс-превращений Р700 - первичного донора электрона в ФС 1. Генерацию транстилакоидной разности рН (∆pH) регистрировали с помощью парамагнитного зонда ТЕМПамин. Показано, что при хранении изолированных хлоропластов (4°С) они сначала теряют способность поддерживать к светозависимой генерации ∆pH, а затем у них падает фотохимическая активность ФС 2. Падение фотохимической активности хлоропластов и их способности генерировать ∆pH замедляются в присутствии 0,5 - 1,0 М трегалозы и, в меньшей степени, в присутствии сахарозы. Методом спиновых меток начато исследование влияния осмолитов на липидный матрикс, окружающий ФС 1 и ФС 2. В качестве индикаторов структурного состояния использовали водорастворимые и липидорастворимые спиновые зонды. Показано, что ФС 1 является более эффективным восстановителем водорастворимых радикалов, чем ФС 2. В то же время липидорастворимые зонды слабо восстанавливаются этими белками. Этот результат составляет методическую базу для решения важной задачи проекта – выяснения влияния осмолитов на структурное состояние липидного окружения ФС 1 и ФС 2.
2 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Влияние природных осмолитов и температуры на светозависимый перенос зарядов в реакционных центрах пигмент-белковых комплексов фотосистем 1 и 2
Результаты этапа: 1. Проведено молекулярно-динамическое моделирование ФС 1 в липидном бислое и в трегалозной матрице. Полученные оценки конформационной подвижности и диэлектрической проницаемости белка позволяют охарактеризовать механизм протекторного эффекта трегалозы на молекулярном уровне. Количественные оценки диэлектрических свойств системы необходимы для расчета сдвигов редокс-потенциалов железо-серных кластеров в ФС 1 в модифицированном окружении (в стекловидных трегалозных матрицах). На молекулярном уровне продемонстрировано, что трегалозная матрица, в первую очередь, влияет на диэлектрические свойства периферических областей белка. 2. На ядерных комплексах фотосистемы 2 (ФС 2), лишенных марганцевого кластера, показано, что биопротекторы трегалоза и гидроксиэктоин (Ect-OH) в растворе не влияют на кинетику рекомбинации зарядов между хинонным акцептором QA и редокс-активным тирозином Yz. Однако при высушивании препаратов ФС 2 в стекловидной трегалозной матрице наблюдается обратимое ингибирование прямого переноса электрона от Yz на окисленный первичный донор Р680+. В таких условиях наблюдается рекомбинация зарядов между QA- и Р680+. 3. На выделенных из шпината мембранных фрагментах ФС 2 было проведено исследование влияния трегалозы и Ect-OH (в сравнении с другими осмолитами – сахарозой и бетаином) на инактивацию водоокисляющего комплекса (ВОК) ФС 2 при нагревании. Степень термоинактивации препаратов ФС 2 определяли по потере кислород-выделяющей активности, а также по потере способности ВОК донировать электроны на реакционный центр (РЦ) ФС 2 (по амплитуде переменной флуоресценции хлорофилла). Показано, что наибольший протекторный эффект оказывает трегалоза, причем кислород-выделяющая активность ВОК оказалась более чувствительной к повышению температуры, чем реакция донирования электрона от ВОК на РЦ ФС 2. Полученные данные показывают, что основное влияние гидроксиэктоина и трегалозы на комплексы ФС 2 заключается в стабилизации ВОК, включая протекторное действие этих соединений на кислород-выделяющую активность, а также на донирование электрона от ВОК на РЦ ФС 2 при повышении температуры вплоть до 50ºС. 4. Изучено действие трех различных осмолитов (сахароза, трегалоза и гидроксиэктоин) на работу цепи псевдоциклического транспорта электронов в изолированных хлоропластах класса В (тилакоиды). Показано, что все три типа осмолитов проявляют протекторные свойства, двукратно увеличивая эффективность работы ФС 2 и удлиняя время старения хлоропластов при хранении при 4ºС. Наиболее заметно это проявляется для трегалозы и сахарозы. При этом также увеличивается время инкубации хлоропластов, в течение которого сохраняется целостность замкнутых тилакоидов и их способность поддерживать транстилакоидную разность pH. Изучение влияния осмолитов на структурные характеристики липидных областей тилакоидных мембран методом спиновых зондов не выявило заметных изменений в липидных областях мембраны при добавлении осмолитов. В совокупности с данными по изучению фотоиндуцированных редокс-превращений Р700, это позволяет заключить, что протекторное действие осмолитов (сохранение фотохимической активности ФС 1 и ФС 2) связано, прежде всего, с их влиянием на структурно-динамическое состояние белковых субъединиц, входящих в РЦ ФС 1 и ФС 2. Эти результаты находятся в хорошем согласии с результатами наших молекулярно-динамических исследований о влиянии осмолитов на динамические свойства изолированных пигмент-белковых комплексов ФС 1 и ФС 2.
3 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Влияние природных осмолитов и температуры на светозависимый перенос зарядов в реакционных центрах пигмент-белковых комплексов фотосистем 1 и 2
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".