| 1 |
19 апреля 2010 г.-31 декабря 2010 г. |
Изучение механизма сопряжения натрий-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы |
| Результаты этапа: Na+-транслоцирующая NADH:хинон-оксидоредуктаза (NQR) является компонентом дыхательной цепи у различных бактерий, генерирующих редокс-зависимый трансмембранный электрохимический натриевый потенциал. Ферментативная активность NQR специфично ингибируется низкими концентрациями ионов серебра. В ходе выполнения данного проекта проведена замена консервативного остатка Cys-377 на аланин в субъединице NqrF фермента из Vibrio harveyi и показано, что данная замена приводит к тому, что активность белка становится устойчивой к ингибирующему действию ионов серебра и других тяжелых металлов. Анализ каталитической активности также показал, что скорость входа электронов в мутантный NQR уменьшается примерно в 14 раз по сравнению с ферментом дикого типа. В то же время, все остальные свойства NqrFC377A NQR, включая его термостабильность, остаются без изменений.
NQR содержит 4 различные флавиновые простетические группы, в том числе два остатка FMN, ковалентно связанных в субъединицах NqrB и NqrC. В ходе выполнения проекта NQR из Vibrio harveyi был уравновешен в присутствии высоких концентраций ионов натрия при различных значениях редокс-потенциала так, что были приготовлены две пробы, где оба FMNNqrB и FMNNqrC или только FMNNqrB находились в парамагнитном состоянии. Было проведено сравнительное изучение этих проб с использованием импульсной EPR-, ENDOR- и ELDOR-спектроскопии. Эхо-детектируемые EPR-спектры и релаксационные свойства радикальных сигналов оказались практически одинаковыми для обеих проб. Расщепление внешних пиков в протонных ENDOR-спектрах (сигналов от протонов C(8α) метильной группы) позволило идентифицировать оба радикала в качестве анионных флавосемихинонов. С помощью ELDOR-спектроскопии было показано, что межспиновое расстояние между этими радикалами составляет 20,7 Å, что позволяет установить расстояние между краями этих простетических групп (re) как: 11,7 Å < re < 20,7 Å. Исходя из этих данных, предположен прямой перенос электрона между FMNNqrB и FMNNqrC в ходе каталитического оборота NQR. |
| 2 |
19 апреля 2011 г.-31 декабря 2011 г. |
Изучение механизма сопряжения натрий-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы |
| Результаты этапа: В ходе данной работы проведен поиск водорастворимых белков, несущих в своем составе флавин-связывающий домен, гомологичный субъединице NqrC Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы. В качестве объекта для дальнейших исследований был выбран гипотетический белок SO4620 из Shewanella oneidensis MR-1. Проведена гетерологическая экспрессия гена so4620 в клетках Vibrio cholerae и очистка рекомбинантного белка. Было показано, что он содержит в своем составе ковалентно связанный флавин. Таким образом, получена удобная модель для дальнейших структурных и функциональных исследований изучаемого FMN-связывающего домена.
В наших руках оказался очищенный белок с неизвестными функциями. В базах данных он аннотирован как фумаратредуктаза. Однако нам не удалось зарегистрировать какой-либо фумаратредуктазной или сукцинатдегидрогеназной активности выделенного рекомбинантного белка SO4620. Таким образом, этот белок должен быть каким-то новым, еще неисследованным ферментом, и было бы заманчивым установить его ферментативную активность и физиологическую роль в клетках бактерий. Классическое биохимическое исследование заключается в выделении и характеризации фермента, катализирующего уже известную реакцию. Выполнение такой задачи может оказаться довольно сложным, однако она заведомо решается с помощью стандартных, хорошо отработанных подходов. В нашем же случае мы столкнулись с обратной задачей, когда необходимо установить катализируемую реакцию для уже выделенного белка. Несмотря на то, что эта задача кажется намного более простой, для ее решения не существует стандартных подходов, заведомо ведущих к ее успешному решению.
В ходе данной работы за счет сравнительного анализа первичной последовательности белка SO4620, определения термодинамических характеристик его простетических групп и исследования расположения генов его гомологов в геномах различных бактерий удалось теоретически предсказать катализируемую этим ферментом химическую реакцию. Последующие эксперименты полностью подтвердили данное предсказание. В ходе нашей работы показано, что SO4620 является уроканатредуктазой. Ферменты, катализирующие восстановление уроканата, ранее не были описаны в литературе. Физиологические эксперименты на S. oneidensis MR-1 показали, что эта бактерия способна использовать уроканат при анаэробном росте в качестве терминального акцептора электронов. Данная функция, по-видимому, является основной физиологической ролью белка SO4620.
Методом импульсной ЭПР-спектроскопии в X-диапазоне исследованы релаксационные свойства анионных флавосемихинонов Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы (NQR) при уравновешивании фермента при рН 9,5 и редокс-потенциале –300 мВ. Показано, что межспиновое расстояние между этими радикалами в отсутствии ионов натрия составляет 15,2 Å.
Исследовано влияние различных факторов (присутствия различных детергентов и ингибиторов NQR, различных значений рН, ионной силы и т.д.) на значение температуры плавления данного белка за счет измерения флуоресценции флавиновых кофакторов NQR в ходе его тепловой денатурации. |
| 3 |
19 апреля 2012 г.-31 декабря 2012 г. |
Изучение механизма сопряжения натрий-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы |
| Результаты этапа: Na+-транслоцирующая NADH:хинон-оксидоредуктаза (NQR) является компонентом дыхательной цепи у различных бактерий, генерирующих редокс-зависимый трансмембранный электрохимический натриевый потенциал. Ферментативная активность NQR специфично ингибируется низкими концентрациями ионов серебра. В ходе выполнения данного проекта проведена замена консервативного остатка Cys-377 на аланин в субъединице NqrF фермента из Vibrio harveyi и показано, что данная замена приводит к устойчивости ферментативной активности к ингибирующему действию ионов серебра и других тяжелых металлов. Анализ каталитической активности также показал, что скорость входа электронов в мутантный NQR уменьшается примерно в 14 раз по сравнению с ферментом дикого типа. В то же время, все остальные свойства NqrFC377A NQR, включая его термостабильность, остаются без изменений.
NQR содержит 4 различные флавиновые простетические группы, в том числе два остатка FMN, ковалентно связанных в субъединицах NqrB и NqrC. В ходе выполнения проекта с помощью анаэробного равновесного окислительно-восстановительного титрования показано, что изменение концентрации Na+ в реакционной среде не оказывают влияния на термодинамические свойства простетических групп этого фермента. Однако, изменение концентрации ионов натрия значительно изменяло ЭПР-спектральные свойства радикальной пары, сформированной двумя анионными семихинонами остатков FMN, связанных с субъединицами NqrB и NqrC (FMNNqrB и FMNNqrC). Результаты экспериментов с использованием импульсной ЭПР-спектроскопии в X- и Q-диапазонах, а также импульсных ENDOR- и ELDOR-спектроскопии позволили определить межспиновое расстояние между FMNNqrB и FMNNqrC как 15,3 Å в отсутствии, и 20,4 Å в присутствии ионов Na+, соответственно. Таким образом показано, что расстояние между ковалентно связанными остатками FMN могут изменяться приблизительно на 5 Å при изменении концентрации ионов натрия. С использованием полученных результатов была предложена схема генерации натриевого потенциала NQR, основанная на окислительно-восстановительных и натрий-зависимых конформационных изменениях в этом ферменте.
В ходе выполнения данного проекта проведен поиск водорастворимых белков, несущих в своем составе флавин-связывающий домен, гомологичный субъединице NqrC Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы. В качестве объекта для дальнейших исследований был выбран гипотетический белок SO_4620 из Shewanella oneidensis MR-1. Проведена гетерологическая экспрессия гена so_4620 в клетках Vibrio cholerae и очистка рекомбинантного белка. Было показано, что он содержит в своем составе ковалентно связанный флавин. За счет сравнительного анализа первичной последовательности белка SO_4620, определения термодинамических характеристик его простетических групп и исследования расположения генов его гомологов в геномах различных бактерий удалось теоретически предсказать катализируемую этим ферментом химическую реакцию. Последующие эксперименты полностью подтвердили данное предсказание. В ходе нашей работы показано, что SO_4620 является уроканатредуктазой. Ферменты, катализирующие восстановление уроканата, ранее не были описаны в литературе. Физиологические эксперименты на S. oneidensis MR-1 показали, что эта бактерия способна использовать уроканат при анаэробном росте в качестве терминального акцептора электронов. Данная функция, по-видимому, является основной физиологической ролью белка SO_4620. |
