ИСТИНА

Митохондрии изначально рассматривались как «микроэлектростанции», функция которых сводится к обеспечению клетки энергией в виде АТФ. Многие годы они были предметом изучения относительно узкой группы специалистов-биоэнергетиков. Однако около 20 лет назад было обнаружено, что эти органеллы также обладают рядом иных, жизненно важных и уникальных функций. Стало ясно, что именно митохондрии обеспечивают генерацию критических сигналов для клеточной пролиферации, дифференцировки, гибели или наоборот, выживания клетки после поступления сигнала на смерть. Они играют центральную роль в таких процессах, как апоптоз, некроз, воспаление, реакция на стресс, поддержание клеточности органов, а также в широком спектре патологий (инсульты, инфаркты, диабет, почечная недостаточность и др.) Кроме того, состояние митохондрий имеет огромное значение для проявления возрастной деградации и дисфункции органов и систем, определяющих нормальное или преждевременное старение организма. Важнейшим фактором, опосредующим эти явления, оказались генерируемые митохондриями активные формы кислорода (мАФК). Эти открытия вызвали резкий рост интереса ученых к митохондриям, и на настоящий момент их изучение – одно из основных направлений биологии во всем мире. Основное слабое место сотен научных групп, работающих по данной теме, заключается в отсутствии старой, классической школы митохондриологии, сочетающей в себе знание как основ биоэнергетики, так и структурно-функциональных особенностей митохондрий. Большинство современных исследователей перешли к изучению митохондрий из молекулярной и клеточной биологии, а также медицины, и не имеют должного «митохондриологического» образования. Следствием этого является, как правило, узкая специализация и сфокусированность каждой лаборатории на лишь одном из многочисленных аспектов митохондриальных функций. Важным преимуществом коллектива настоящего проекта является сочетание многолетнего опыта и знаний, как в области классической биоэнергетики, так и в области физико-химической, молекулярной и клеточной биологии митохондрий, а также владения широким спектром современных методов изучения митохондрий, от молекулярного до организменного уровня. В данном проекте собраны научные силы с самым высоким уровнем экспертизы не только в России, но в мире (что подтверждается импакт-фактором публикаций и рекордным для России цитированием членов проекта; см. приложенный материал). Проект направлен на прояснение роли митохондрий в молекулярных механизмах, определяющих судьбу живой клетки и организма. Планируется разработка широкого спектра новых методов изучения митохондрий, от молекулярного моделирования с применением самых мощных суперпкомпьютеров МГУ им. М.В.Ломоносова, до опытов на целом организме по предотвращению патологических изменений и запрограммированной гибели организма – феноптоза (термин предложен и введен в употребление в международном научном сообществе руководителем проекта). В результате работ по проекту будут разработаны новые инструменты для изучения структуры и функции митохондрий, в первую очередь – митохондриально-направленные соединения. Специфическая адресованность этих агентов обуславливается наличием в них положительного заряда, экранированного от гидратации группами-заместителями. Благодаря этим свойствам, данные катионы накапливаются в митохондриях, отрицательно заряженных относительно цитозоля, в многократном избытке. Первые подобные соединения были описаны руководителем проекта и вошли в науку как «ионы Скулачева», после того как им и его коллегами было открыто явление митохондриального лектричества (генерации разности электрического потенциала между матриксом митохондрий и цитозолем). Свойства новых соединений, синтезированных в ходе проекта, будут изучены как на модельных искусственных мембранных системах, так и на изолированных митохондриях животных и дрожжей. С помощью этих соединений будут решаться следующие задачи: 1) Выяснение молекулярных механизмов и путей регуляции избирательной деградации митохондрий (митофагии и митоптоза) при окислительном стрессе. Эта задача является актуальной, т.к. основная часть митохондриальных активных форм кислорода (мАФК) может продуцироваться небольшой фракцией дефектных митохондрий, и малоизученный процесс их избирательного элиминирования может играть важную роль при выборе клетки между жизнью и смертью. 2) Прояснение деталей механизмов эндогенных адаптивных клеточных сигнальных каскадов, направленных на защиту клетки от окислительного повреждения и идущих с участием митохондрий с акцентом на нейрологические патологии (ишемия и травма мозга, модели болезни Альцгеймера) 3) Изучение функционирования митохондрий животных в их естественном окружении, то есть без их выделения из клетки; расшифровка эндогенных сигнальных системы защиты клетки, в которых задействованы митохондрии, в частности – системы антиишемической защиты. 4) Поиск естественных регуляторов энергетической функции митохондрий методом генетического скрининга на одноклеточных эукариотах. По результатам скрининга с помощью геномного анализа будут найдены гомологи таких естественных регуляторов у млекопитающих и изучена их функция. 5) Разработка модели запрограммированной гибели организма, вызванной воздействием, которое само по себе не является смертельным. На этой модели будут детально сследованы изменения статуса митохондрий на всех стадиях патогенеза. По полученным в ходе проекта данным, а также по данным литературы, будет осуществлено математическое моделирование основных процессов митохондриального гомеостаза, в первую очередь, начальных стадий вызванной митохондриальными процессами запрограммированной клеточной гибели, и выяснение возможности контролированного фармакологического воздействия на эти процессы. Для этого предполагается сочетать теоретические методы биоинформатики, молекулярно-динамические симуляции и кинетическое моделирование (в том числе – с использованием суперкомпьютеров МГУ). Результаты работы проекта будут использованы для разработки новых методов профилактики и репарации окислительного повреждения митохондрий при помощи исследуемых соединений, в первую очередь – посредством регуляции уровня активных форм кислорода. Это является актуальнейшей задачей в области терапии патологий, имеющих митохондриальную природу. Важным аспектом предлагаемого проекта является передача практического опыта основных участников молодым исследователям, а также студентам, аспирантам и докторантам. Дополнительным преимуществом здесь является тесное сотрудничество коллектива проекта с факультетом биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В.Ломоносова. Большая часть коллектива проекта задействована в преподавании на факультете. Кроме того, с 2013 года часть студентов факультета имеет дополнительную образовательную программу по совершенно новой специальности «Митоинженерия», сфокусированной на изучении митохондрий. Предполагается, что эти студенты будут активно участвовать в данном проекте, в том числе в ходе выполнения курсовых и дипломных работ, а затем и кандидатских диссертаций, на указанном факультете, основателем и деканом которого является руководитель проекта.

За 2017 г по направлению исследований клеточных механизмов контроля качества было установлено, что подавление аутофагии - важнейшего механизма контроля качества митохондрий - ингибиторами комплекса III (миксотиазола, антимицина, стигмателлина) связано с подавлением синтеза пиримидиновых нуклеотидов в митохондриях. Мы предположили, что ингибиторы комплекса III блокируют синтез фосфолипидов необходимых для аутофагии. В поддержку этого предположения было показано, что интермедиат биосинтеза фосфолипидов цитидин-5'-дифосфохолина (CDPH) предотвращает ингибирование аутофагии под действием миксотиазола. Окончательное подтверждение нашей гипотезы были получены в экспериментах, где фосфолипиды, добавленные в среду инкубации блокировали ингибирующий эффект миксотиазола на аутофагию. В отличие от CDPH, добавление в среду инкубации фосфолипидов не влияет на уровень пиримидинов в клетке, т.е, действие миксотиазола на аутофагию связано с подавлением биосинтеза фосфолипидов. Наряду с описанным эффектом мы предположили, что ингибиторы комплекса III вызывают изменения профиля экспрессии генов участвующих в контроле качества митохондрий. Анализ транскриптома показал, что миксотиазол влияет на экспрессию 32 белков, участвующих в аутофагии. В частности, повышается экспрессия белка LC3, участвующего в формировании фагофора. Парадоксально, мы обнаружили снижение содержания LC3 при длительной (17 ч) инкубации с миксотиазолом. Было показано, что этот эффект не связан с деградацией LC3 после слияния аутофагосом с лизосомами и не предотвращается селективными ингибиторами каспаз и протеасом. Дальнейшие исследования будут направлены на выяснение роли других протеаз и белка р53 в снижении содержания LC3. Предполагается, что в отличие от быстро обратимого эффекта подавления биосинтеза фосфолипидов, деградация LC3 может приводить к необратимому ингибированию аутофагии. Исследование новых митохондриально-направленных прооксидантов показало, что производное нафтохинона, конъюгированного с децилтрифенилфосфонием (SkQN) вызывает мощную генерацию перекиси водорода в изолированных митохондриях сердца крысы. При этом ингибирование комплекса I или NQO1 (ферментов способных восстанавливать нафтохинон) не влияло на SkQN-зависимое образование перекиси водорода. Мы предположили, что остаток нафтохинона в SkQN способен к электрофильной модификации функциональных групп ферментов дыхательной цепи, что приводит к образованию перекиси. Для проверки этой гипотезы был синтезирован аналог SkQN с метилированным хиноидным кольцом нафтохинона (SkQM). В экспериментах на изолированных митохондриях SkQM практически не стимулировал продукцию перекиси, что хорошо согласуется с предполагаемым механизмом прооксидантного действия SkQN. Токсическое действие SkQN и SkQМ было исследовано на нескольких линиях опухолевых клеток и на нормальных подкожных фибробластах человека. Токсическое действие SkQN блокировалось антиоксидантами и снижалось в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования (FCCP) рассеивающего мембранный потенциал на мембране митохондрий. Токсичность SkQN для клеток была существенно выше, чем в случае SkQМ. Таким образом, токсическое действие SkQN было связано с избыточной продукцией АФК в митохондриях. Сравнение токсического действия SkQN на клетки карциномы простаты, клетки рака шейки матки, клетки фибросаркомы и рабдомиосаркомы не выявило заметных различий с токсичностью по отношению к нормальным фибробластам. Для проверки роли раковой трансформации в токсичности SkQN были выбраны нормальные легочные фибробласты человека (линия MRC5) и клетки MRC5, трансформированные онкогенным вирусом SV40. Сравнение этих двух линий не выявило отличий в токсическом действии SkQN. Таким образом, несмотря на высокую токсичность митохондриально-направленного прооксиданта, не получено указаний на перспективность его применения в противоопухолевой терапии. Также в 2017 г были получены предварительные данные о предполагаемом проэстрогеновом действии катионов трифенилфосфония (SkQ1, SkQR1 и C12TPP) на клетках карциномы молочной железы человека MCF-7, экспрессирующих эстрогеновый рецептор альфа (ЭР-альфа). По результатам трех экспериментов наблюдалось небольшое, статистически недостоверное, увеличение пролиферации клеток MCF-7 (МТТ-тест) под действием катионов трифенилфосфония и 17-бета-эстрадиола. Это действие подавлялось фульвестрантом, антагонистом ЭР-альфа. Проведено сравнение действия SkQ1 и 17-бета-эстрадиола на экспрессию эстроген-зависимых генов (greb1, igfbp4, nd6, nd4, tfam,cox6, tff1) в клетках MCF-7. Обнаружено, что: (1) SkQ1 и 17-бета-эстрадиол увеличивают экспрессии генов greb1, igfbp4; (2) только 17-бета--эстрадиол, но не SkQ1 увеличивает экспрессию tff1; (3) только SkQ1 увеличивает экспрессию cox6; (4) на экспрессию остальных генов исследуемые вещества не влияли. По направлению изучения митохондрий на дрожжевых моделях мы показали, что добавление разобщителей может препятствовать клональной экспансии мтДНК, содержащей большую делецию. Мы обнаружили, что этот эффект связан с активацией Atg32-зависимой митофагии. Ранее считалось, что у дрожжей разобщители не способны активировать митофагию, однако, мы показали, что это не так в клетках с гетероплазмией. Еще одним направлением нашей работы было изучение YSP-генов, два из которых (YSP1 и YSP2) были открыты ранее в нашем институте. Ранее нами было показано, что делеция этих генов влияет на структуру митохондриальной сети при стрессе, вызванном амиодароном, а также в стационарной фазе роста. В отчетный период нам удалось обнаружить, что эти гены также необходимы для адаптации клеток дрожжей к стрессорным условиям. Делеция гена YSP2 приводила к увеличенной чувствительности клеток дрожжей к гиперосмотическому стрессу, тепловому шоку и замерзанию. Сверхэкспрессия YSP2, наоборот, делала клетки более устойчивыми к гиперосмотическому стрессу. Результаты этого направления исследования представлены на FEBS конгрессе. В области изучения роли митохондрий на ранних стадиях апоптоза было установлено, что перекисное окисление липидов митохондрий происходит в результате взаимодействия цитохрома с с кардиолипином липосом, изменения его конформации и приобретения им пероксидазной активности. В этой системе добавление мутантного белка с заменами K86A/K87A приводило к практически полному подавлению пероксидазной активности цитохрома с . Вероятно, для связывания с кардиолипином белок должен иметь положительный заряд и замена ключевых лизинов 86 и 87 на нейтральные аланины приводит к подавлению такого взаимодействия. Кроме того, впервые было продемонстрировано взаимодействие между циклическим аденозин 3′,5′- монофосфатом (cAMP), одним из наиболее важных регуляторных молекул в живых организмах, и митохондриально-направленным антиоксидантом SkQ1. Данные, полученные на моделях жидкой мембраны и тромбоцитах человека, показали способность SkQ1 к селективному транспорту cAMP через модельные и природные мембраны, в то время как циклический гуанозин 3′,5′-монофосфат не транспортировался. В частности, SkQ1 вызывал транспорт cAMP через ячейку Прессмана, в то время как cGMP оставался в приемном отделении ячейки. Следует отметить, что в отличие от SkQ1, лишенный хинона додецилтрифосфоний, был неэффективен при транспорте cAMP через мембрану. В случае тромбоцитов, SkQ1 также мог служить в качестве переносчика cAMP, но не cGMP, снаружи клеток в цитоплазму, что регистрировалось по фосфорилированию вазодилятор-стимулируемого белка. Было предположено, что перенос cAMP через мембраны под действием SkQ1 может влиять на сигнальные функции cAMP в клетках. Также была изучена роль окислительного стресса и повреждений в патологических старческих изменениях, в соответствии с митохондриальной теорией старения. По нашим представлениям принципиальное отличие молодого и старого организмов заключается не в самом наличие стресса и возникновении повреждений, а в способности к их репарации. Так нами были подобраны условия для мягкой и короткой (однократная 15 секундная ишемия) ишемической тренировки почечной ткани (прекондиционированию), что делало ее устойчивой к серьезному ишемическому повреждению (40 минутной ишемии). Однако данная тренировка обеспечивала защиту только у молодых животных, но не работала у старых. Этот эффект связан именно с тем, что подобная тренировка активизировала механизмы репарации окислительных повреждений у молодых животных, и к моменту длительной ишемии они были уже активны, что и снижало повреждающее воздействие, тогда как у старых животных эти механизмы не активировались подобной тренировкой. Нами также были исследованы еще несколько подходов к предварительной тренировке органов: удаленное ишемической прекондиционирование (УИП), при котором ишемической тренировке подвергается один орган, а повреждающему воздействию – другой. Например, для защиты мозга от инсульта может применяться тренировка почки и даже конечности (достигаемая просто ее короткими пережатиями, в частности процесс измерения давления с манжетой на руке во многом является прекондиционирующим воздействием). Нами было показано, что УИП конечности приводит к статистически значимому снижению неврологической симптоматики через 24 ч после ишемии. УИП конечности сопровождалось значительным повышением в мозге уровня белков, ассоциированных с индукцией ишемической толерантности, таких как pGSK-3-бета, BDNF и HSP70. Кроме этого мы показали, что такие анестетики, как золетил и хлоралгидрат также обладают прекондиционирующим эффектом. Параллельно нами ведется работа по исследованию сепсис-подобных состояний, для которых известна лидирующая роль окислительного стресса, как главного повреждающего фактора. В частности, мы показали, что сепсис-подобный ответ может возникать не только на бактериальную инфекцию, но и на введение изолированных митохондрий. Данные исследования представляют интерес прежде всего тем, что при получении травм в кровоток может попадать большое количество митохондрий, что может вызывать сепсис-подобный ответ и приводить к гибели организма. Например, вполне вероятно, что смертность при краш-синдроме (токсикозе, вызванном резким попаданием в кровоток продуктов повреждения тканей) определяется именно сепсис-подобной реакцией организма на собственные митохондрии. Наконец, было исследовано влияние митохондриально-направленных антиоксидантов на состояние коллапса у животных, вызванного введением стрептозотоцина в желудочки головного мозга. Результаты эксперимента показали, что SkQT1 и SkQ1 не оказывали достоверного влияния на развитие коллапса, в отличие от ранее показанного эффекта SkQTR1. Видимо, позитивный эффект последнего связан с присутствием родаминовой группы.