ИСТИНА

Выделить цитохромы bd-I и bd-II из Escherichia coli. Провести масштабные выращивания штаммов GO105/pTK1 и MB37. Из выращенных клеток получить сферопласты и субклеточные везикулы. Часть субклеточных везикул использовать для выделения и очистки ферментов. Измерить генерацию цитохромом bd-II из E. coli электрического потенциала в стационарных условиях. Измерить генерацию цитохромом bd-II из E. coli градиента рН в стационарных условиях. Определить биоэнергетическую эффективность генерации протонного потенциала (соотношение H+/e-) цитохромом bd-II из E. coli. Научиться встраивать изолированный очищенный цитохром bd-II из E. coli в искусственные фосфолипидные везикулы (протеолипосомы). Добиться получения протеолипосом со встроенным ферментом, пригодных для мониторинга генерации мембранного потенциала. Подобрать соответствующие условия и изучить генерацию мембранного потенциала встроенным в липосомы цитохромом bd-II из E. coli в пределах одного молекулярного оборота (каталитического цикла) фермента. Выяснить, на каких именно частных стадиях каталитической реакции происходит образование потенциала.

Выделены цитохромы bd-I и bd-II из Escherichia coli. Выращены клетки штаммов GO105/pTK1 и MB37 и получены сферопласты. Измерена генерация цитохромом bd-II электрического потенциала в стационарных условиях. Исследование проводили на свежевыделенных замкнутых везикулах с вывернутой ориентацией мембран с использованием липофильного дельта-пси-чувствительного анионного красителя оксонол VI. Добавление убихинола-1 или АТФ вызывало спектральный сдвиг оксонола VI, что указывает на образование потенциала в вывернутых везикулах (положительный заряд внутри). Образовавшийся потенциал полностью сбрасывался при добавлении каналоформера грамицидина. Электрический потенциал на бактериальной мембране образуется либо благодаря работе F0F1-ATФазы (при добавлении АТФ), или за счет хинол-оксидазной активности (при добавлении убихинола-1). Следовательно, именно цитохром bd-II генерирует электрический потенциал в стационарных условиях, поскольку этот фермент - единственная хинол-оксидаза, присутствующая в мембране. Измерена генерация цитохромом bd-II градиента рН в стационарных условиях. О закислении внутреннего объема везикул судили по тушению флуоресценции pH-чувствительного красителя акридиновый оранжевый. Добавление убихинола-1 или АТФ приводило к тушению флуоресценции акридинового оранжевого, демонстрируя закисление (образование дельта рН) внутреннего объема везикул. Образовавшийся градиент рН сбрасывали добавлением каналоформера грамицидина. Каталитический оборот цитохрома bd-II сопровождается высвобождением протонов с периплазматической стороны мембраны, что эквивалентно внутренней стороне вывернутых везикул. Определена биоэнергетическая эффективность генерации протонного потенциала (соотношение H+/e-) цитохромом bd-II. Это соотношение оказалось равным 0,94 +/- 0,18 H+/e-. В качестве контроля использовали цитохром bd-I в тех же экспериментальных условиях и получили то же значение H+/e- (1,0 +/- 0,07). Таким образом, обе терминальные оксидазы, - цитохромы bd-I и bd-II, обладают одинаковой биоэнергетической эффективностью генерации протонного потенциала (H+/e- ~ 1). Подобраны условия и изучена генерация мембранного потенциала встроенным в липосомы очищенным цитохромом bd-II в пределах одного молекулярного оборота фермента. Выяснено, на каких именно частных стадиях каталитической реакции происходит образование потенциала. Типичная электрометрическая кривая для цитохрома bd-II состоит из двух частей: более быстрой неэлектрогенной (лаг-фаза) и более медленной – электрогенной. Лаг-фаза включает в себя два последовательных неэлектрогенных события с временами 2,1 и 7,3 мкс, что отражает образование оксикомплекса (R->A переход) и затем перекисного комплекса (А->Р переход). Происходящий за ними P->F переход (превращение перекисного интермедиата в оксоферрильный), с временем 70 мкс, вносит основной вклад в электрогенную часть ответа (~90% от общей амплитуды). Последняя, 440-мкс фаза генерации потенциала (~10% от общей амплитуды) вероятнее всего соответствует самому медленному переходу (F->О, превращение оксоферрильного интермедиата в окисленную форму), происходящему во фракции фермента со связанным хинолом. Контроль с цитохром bd-I показал похожие результаты. Таким образом, оба фермента, - цитохромы bd-I и bd-II, образуют мембранный потенциал в пределах одного каталитического цикла, вероятно, задействуя при этом схожие молекулярные механизмы. Полученные данные опровергают выводы работ групп М.Дж. де Маттоса (Нидерланды) и Р.К. Пула (Великобритания), согласно которым цитохром bd-II из E. coli не является первичным генератором протон-движущей силы.