ИСТИНА

Изучение роли белок-белковых взаимодействий в регуляции метаболизма и формировании амилоидных структур с использованием биоинформационных и экспериментальных подходов

В ходе реализации проекта было проведено изучение роли различных типов белок-белковых взаимодействий в регуляции жизнедеятельности клетки в нормальных условиях и при различных патологиях. Совместно с зарубежными участниками проекта был проведен отбор белков, пригодных для изучения роли белок-белковых взаимодействий в регуляции метаболизма и выявлены сайты фосфорилирования в составе последовательностей отобранных белков. В качестве основных объектов исследования были выбраны два изофермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) – соматический (ГАФД) и спермоспецифический (ГАФД-с), а также прионы и бета-казеины. Сравнение сайтов фосфорилирования двух изоферментов ГАФД указывает на то, что активность ГАФД-с регулируется механизмами, отличными от механизмов регуляции соматической ГАФД. Об этом свидетельствует отсутствие сайтов фосфорилирования протеинкиназами EFGR, C и CamKII в составе ГАФД-с. С помощью кинетических методов и лазерного динамического светорассеяния показано, что ГАФД взаимодействует с 3-фосфоглицераткиназой, причем биферментный комплекс образуется с ацил-фосфатной формой ГАФД. Фосфорилирование ГАФД протеинкиназой не влияет на эффективность образования комплекса. Совместно с зарубежными участниками проекта было проведено изучение происхождения и эволюции изоформ глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, включая изменения участков фосфорилирования. В частности, было исследовано возникновение полипролинового домена сперматозоидной ГАФД, его роль во взаимодействии с белками цитоскелета и значение альтернативного сплайсинга в этих процессах. Было проведено исследование агрегации амилоидогенных белков (рекомбинантных овечьих прионов и молочных бета-казеинов). Анализ данных фосфопротеома и экспериментальные исследования показали, что фосфорилирование бета-казеинов играет ключевую роль в формировании амилоидоподобных агрегатов, обладающих выраженными аллергенными свойствами. Дефосфорилирование бета-казеинов и введение в их состав цистеиновых остатков (с помощью генно-инженерных методов) позволяет изменить их аллергенность. Методами молекулярного моделирования выявлены (совместно с зарубежными партнерами) особенности разворачивания двух форм прионов PrP-VRQ и PrP-ARR (чувствительный и нечувствительный к заболеванию «скрепи» варианты). Доказано участие шаперонинов в амилоидогенной трансформации прионов. Изучены фосфорилированные амилоидогенные белки в составе белковых агрегатов, полученных из спинномозговой жидкости пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. Зарубежными участниками проведен анализ сайтов фосфорилирования в белках мозга. С помощью разработанных подходов для количественного определения фосфорилированных пептидов было выявлено 12 035 сайтов фосфорилирования в 4579 белках мозга. В образцах спинномозговой жидкости пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, были обнаружены белковые агрегаты, отсутствующие в контрольных пробах, и исследован белковый состав агрегатов. Эти наблюдения могут быть использованы для разработки новых способов диагностики амилоидных нейродегенеративных заболеваний. Продемонстрирована возможность использования полиэлектролитов для регулирования агрегации и дезагрегации белков. Разработаны способы разрушения белковых «телец включения», пригодные как для выделения белков, так и для разрушения белковых агрегатов, образующихся при нейродегенеративных заболеваниях. По результатам совместных исследований опубликовано 11 статей в рецензируемых научных журналах и 1 статья в сборнике, участниками проекта было сделано 15 сообщений на всероссийских и международных конференциях, завершены и защищены 3 диссертационные работы, одна диссертационная работа завершена и подготовлена к защите. Участники проекта участвовали в совместных рабочих совещаниях с немецкими коллегами, проводили практикумы по физическим методами исследований для немецких аспирантов на базе НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ, а также проходили обучение практическим навыкам по в измерению уровней экспрессии генов в Университете Людвига-Махсимилиана в Мюнхене.