ИСТИНА

Основная цель проекта - исследование влияния наномолярных концентраций биологически активных веществ на культивируемые нормальные и опухолевые клетки человека. Задачи состояли в том, чтобы: 1. Определить, индуцируют ли микро- и миллимолярные дозы биологически активных веществ помимо апоптоза такие варианты программированной клеточной гибели, как аутофагию, программированный некроз, энтоз, анойкис и т.д. Если такие формы будут обнаружены, проанализировать зависимость уровня каждого из вариантов гибели от дозы воздействия. 2. Определить, существуют ли различия в механизмах апоптоза и других форм программированной гибели при индукции этих процессов в нормальных и опухолевых клетках. 3. Выявить механизмы устойчивости нормальных клеток при тех цитотоксических дозах некоторых типов биологически активных веществ (например, абсцизовой кислоты), которые вызывают гибель только опухолевых клеток и не влияют на жизнеспособность нормальных клеток. 4. На моделях индуцированной дифференцировки клеток проанализировать возможность регуляции наномоляными концетрациями биологически активных веществ некоторых физиологических процессов, включенных в дифференцированный статус клеток.

Производное антиоксиданта витамина Е альфа-токоферилсукцинат витамина Е (СВЕ) обладает потенциальным противоопухолевым свойством, так как вызывает гибель трансформированных клеток культуры А431 (эпидермоидная карцинома человека). Было показано, что при воздействии сукцината витамина Е в концентрации 40 мкМ после 48 ч инкубации наблюдается изменение формы части клеток и реорганизация в этих клетках актинового цитоскелета. Проведено исследование характера воздействия сукцината витамина Е на культуру иммортелизованных нормальных кератиноцитов человека НаСаТ. Обнаружено, что те дозы агента, которые индуцируют апоптоз в культуре опухолевых клеток А431, не вызывают клеточной гибели в культуре нормальных кератиноцитов. В культуре клеток НаСаТ при воздействии СВЕ также не обнаружено изменение формы клеток и структуры актинового цитоскелета. Было проведено исследование цитотоксичности таких растительных гормонов, как жасмоновая, абсцизовая и гиббереллиновая кислоты на клетки А431 и НаСаТ. С помощью МТТ теста показан цитотоксический эффект только жасмоновой кислоты для нормальных и трансформированных клеток. Выявлено незначительное цитотоксическое действие гиббереллиновой кислоты на опухолевые клетки и отсутствие цитотоксического действия абсцизовой кислоты как на опухолевые, так и на нормальные клетки. Кроме того, растительные гормоны вызывают изменение состояния аппарата Гольджи как в трансформированных, так и нормальных клетках. Однако несмотря на явные изменения в состоянии аппарата Гольджи трансформированных и нормальных клеток, реакция везикул кислого компартмента регистрируется только при действии абсцизовой кислоты на нормальные клетки. Для того, чтобы установить, какие клеточные органеллы, кроме вакуолярной системы, реагируют на действие растительных гормонов, было проведено цитохимическое окрашивание митохондрий флуоресцентным красителем Mitotracker Green. Данный метод визуализации митохондрий показал, что митохондрии в трансформированных клетках реагируют на действие жасмоновой и абсцизовой кислоты, но эти реакции отличаются. Жасмоновая кислота вызывает изменение состояния (морфологии) митохондрий, а абсцизовая кислота – их локализацию. Многие процессы в клетках связаны с элементами цитоскелета, поэтому было проведено исследование реакции актиновых филаментов и микротрубочек на действие растительных гормонов. Исследования актинового цитоскелета показали, что нормальные и трансформированные клетки имеют гетерогенную организацию системы актиновых филаментов, которая, к тому же, зависит от состояния клеточной популяции (монослой, одиночные клетки, островки). Поэтому проследить за реакцией этой системы на действие растительных гормонов довольно сложно, тем более уловить тонкие изменения, которые могут предшествовать более серьезным проявлениями реакции. Тем не менее, один из растительных гормонов, а именно гиббереллиновая кислота, вызывает явное повышение активности периферической цитоплазмы, что может быть связано с изменением регуляции полимеризации актина в этой области. Микротрубочки выявляли с помощью иммуноцитохимического окрашивания антителами к α-тубулину. Анализ состояния системы микротрубочек в трансформированных и нормальных клетках при действии растительных гормонов не выявил серьезных изменений в организации сети микротрубочек. Ранее было показано, что как в культуре клеток эпидермоидной карциномы человека А431, так и в культуре кератиноцитов НаСаТ, выращиваемых на твердом субстрате, основной формой гибели клеток является апоптоз. Однако было покаазно, что в культурах как опухолевых клеток кожи, так и нормальных кератиноцитов выявлен не только апоптотический вариант клеточной гибели, но и клеточный каннибализм. Число таких клеток в культуре А431 составляет 1.1%, а в культуре НаСаТ 0.26% Анализ влияния воздействия растительными гормонами на частоту встречаемости клеточного каннибализма выявил некоторую стимуляцию поглощения клеток клетками: при действии абсцизовой кислоты число клеток-каннибалов возрастает примерно в 1.7 раза, при действии гиббереллиновой кислоты – в 1.9 раза. В культуре клеток НаСаТ наблюдается аналогичная тенденция – увеличение доли клеток-каннибалов примерно в два раза. Форболовый эфир (ФЭ) – один из традиционных индукторов дифференцировки моноцитарных клеток в макрофагальные элементы. При индукции макрофагальной дифференцировки воздействием наномолярных концентраций PMA первоначально происходит прикрепление клеток к твердому субстрату, распластывание и изменение формы клеток, блокирование значительной доли клеток в фазе G1, реорганизация элементов цитоскелета и мембранных органелл, прежде всего аппарата Гольджи, активация фагоцитоза. Для поздних сроков дифференцировки характерно усиление продуцирования АФК и индукция апоптоза. Легочный сурфактант (ЛС) – это сложный мембранный комплекс фосфолипидов (80-90%), белков (8-10%) и углеводов (2-4%), расположенный на внутренней выстилке альвеол, обеспечивающий биомеханику дыхания и, по-видимому, принимающий участие как в реакциях врождѐнного, так и приобретѐнного иммунитета. не являясь индуктором дифференцировки моноцитов в макрофаги, сурфактант оказывает непосредственное влияние на изменение морфологического статуса "молодых" макрофагов, стимулируя увеличение распластанности клеток и формирование отростков. Введение препарата С-БЛ (сурфактант-БЛ ) в материал БАЛ (бронхо-альвеолярного лаважа) вызывало: - снижение числа нефагоцитирующих макрофагов до 25%; - активацию клеточной поверхности, появление многочисленных микровыростов и псевдоподий, направленных к расположенным рядом кольцевидным мембранам сурфактанта, появление последних в фагосомных вакуолях; - активацию лизосомального аппарата в молодых и зрелых фагоцитах: появление в цитоплазме клеток крупных фаголизосом (0,2мкм), не характерных для контрольной группы. Важным моментом является сохранение стимулирующего эффекта сурфактанта на фагоцитарную активность макрофагальных клеток и после удаления С-БЛ из среды. При этом С-БЛ не только активирует фагоцитоз в макрофагах, но стимулирует появление в цитоплазме макрофагов большего числа лизосом, и что особенно важно – фаголизосом, т.е. способствует более полному завершению процесса фагоцитоза.