ИСТИНА

Проект направлен на разработку ингибиторов интеграции кДНК вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) в геном человека. Этот процесс осуществляется вирусным ферментом интегразой (ИН). Ранее было показано, что короткие олигонуклеотиды, содержащие модификации гетероциклических оснований или гидрофобный фрагмент на 5'- или 3'-конце (в том числе эозин), являются эффективными ингибиторами ИН ВИЧ-1 in vitro по неконкурентному механизму, причем связывание модифицированных олигонуклеотидов с комплексом интегразы с субстратной ДНК приводит к разрушению последнего. В результате сотрудничества с НЦНИ (Франция) был подобран пептидный носитель, обеспечивающий проникновение этих конъюгатов в клетки человека и показано, что такие пептидо-олигонуклеотидные комплексы подавляют репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток.

а первом этапе была проведена оптимизация структуры олигонуклеотида для увеличения его ингибирующей активности и стабильности в клетках за счет вариации нуклеотидной последовательности и дополнительной гидрофобной модификации сахаро-фосфатного остова олигонуклеотида. Был осуществлен синтез ряда ингибиторов различной длины и нуклеотидного состава, содержащих остаток эозина на 3'-конце, и продемонстрировано минимальное влияние нуклеотидного состава на эффективность ингибирования при значительном влиянии длины олигонуклеотидного фрагмента. Оптимальным является использование 11-звенного олигонуклеотида. Далее синтезировали ингибиторы, содержащие остаток эозина на 3`- либо на 5`-конце, и показали инвариантность такой модификации. Был осуществлен синтез аналогов олигонуклеотидного ингибитора, содержащего реакционно-способную альдегидную группу в нескольких положениях, и оптимизация условий его кросс-линкинга с ИН. Для комплексов олигонуклеотидного ингибитора, содержащего остаток эозина, с несколькими пептидами, способными проникать через клеточные мембраны была проведена оценка их устойчивости в зависимости от соотношения пептид/олигонуклеотид. В 2010 году в результате варьирования структуры ингибитора нами был выбран оптимальный ингибитор – 11-звенный 2’-О-метильный олигонуклеотид, содержащий остаток 6-карбокси-4,7,2',4',5',7'-гексахлорфлуоресцеина на 5’-конце. Это соединение более эффективно блокирует интегразу, чем ранее предложенный конъюгат с эозином. Кроме того, синтез такого производного существенно проще и легко масштабируется, по сравнению с ранее предложенными вариантами. Кроме того, был обнаружен факт аддитивности влияния ксантеновых красителей и олеиновой кислоты на ингибирующую активность конъюгата. Также показано, что уменьшение заряда олигонуклеотидной части конъюгата приводит к уменьшению ингибирующей активности, а введение тиофосфатных групп увеличивает ингибирующую активность. Уменьшение числа гетероциклических оснований олигонуклеотида за счет замены нуклозидов на остатки пропандиола или дидезоксирибозы приводит к резкому падению ингибирующей способности. В 2011 году нами были синтезированы препаративные количества олигонуклеотидных конъюгатов и переданы французским коллегам из НЦНИ для проведения экспериментов на культуре клеток. Ими продемонстрировано, что конъюгат in vivo ингибирует стадию обратной транскрипции ВИЧ-1 и обладает пониженной активностью по отношению к K103N/Y181C мутантам обратной транскриптазы (ОТ), которые устойчивы к ненуклеозидным ингибиторам ВИЧ-1. Соответственно, нами изучено влияние олигонуклеотидных ингибиторов на полимеразную и РНКазную активности ОТ. Показано, что конъюгат с эозином, способен подавлять РНКазную активность ОТ с IC50 = 250 нМ, а РНК-зависимую ДНК-полимеразную и ДНК-зависимую ДНК-полимеразную активности с IC50 = 1 мкМ, однако в отличие от экспериментов на инфицированных клетках введение в структуру ОТ мутации K103N/Y181C не приводило к изменению ингибирующего действия конъюгата. Этот факт еще требует дополнительных исследований.