|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Изучение механизма проницаемости гидрофобных ионов с делокализованным зарядом и их конъюгатов через бислойные липидные мембраныНИР
- Руководитель НИР: Рокицкая Т.И.
- Участники НИР: Коршунова Г.А., Фирсов А.М., Хайлова Л.С.
- Подразделение: Отдел биоэнергетики
- Срок исполнения: 1 января 2015 г. - 31 декабря 2017 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 15-04-01688
- Номер ЦИТИС: 115013070069
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: другое
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.17.27 Искусственные и биологические мембраны
- 34.17.53 Прикладная биофизика
-
Ключевые слова:
проницаемость, фазовый переход липидов, бислойные липидные мембраны, делокализация заряда, проникающие ионы
-
Описание:
Пассивная проницаемость веществ через мембраны является важной характеристикой любого фармакологического препарата. Процесс проницаемости через мембраны из одного водного раствора в другой включает две основные стадии – стадию связывания с мембраной/отрыв от нее и стадию трансмембранной диффузии. Первая стадия является достаточно хорошо изученной для большого числа фармакологически важных веществ и определяется гидрофобностью этих веществ. Обычно считается, что именно эта стадия определяет весь процесс проницаемости соединений через мембрану, что выражается в корреляции между проницаемостью и их гидрофобностью или коэффициентом распределения в октанол – воде (правило Овертона). Изучение стадии трансмембранной диффузии через липидные мембраны зачастую затруднено, и для большинства соединений не существует простых способов вычленения этой стадии из общего процесса проницаемости. Из литературы известно, что скорость трансмембранной диффузии падает с увеличением размера молекул веществ и увеличением плотности упаковки молекул липида. В то же время нет согласованного мнения о зависимости скорости трансмембранной диффузии от длины алкильного хвоста для таких практически важных соединений как жирные кислоты и другие алкил-замещенные физиологически важные вещества. Изменение или введение алкильных цепочек в молекулах соединений все чаще используется для управления их гидрофобностью, однако ясного представления, как при этом будет меняться их проницаемость через липидные мембраны, до сих пор не сложилось. Большинство заряженных молекул, в том числе и депротонированные жирные кислоты, проникают очень плохо или совсем не проникают через липидные мембраны. Тем не менее существует класс ионов, обладающих делокализованным зарядом, способных проникать через липидные мембраны достаточно быстро. В последние годы такие проникающие ионы активно используются при создании новых конъюгатов для адресной доставки антиоксидантов, разобщителей, фотосенсибилизаторов и других соединений в клеточные компартменты. Во многих случаях терапевтическое действие таких конъюгатов существенно повышается, зачастую благодаря увеличению их диффузии через липидные мембраны. Как выяснилось, эффективность конъюгатов часто зависит и от длины соединяющего линкера. Поэтому важной задачей является изучение зависимости проницаемости таких соединений от длины линкера для прогнозирования условий максимальной эффективности соединений. Ранее полученные в нашей лаборатории результаты позволяют предполагать, что наиболее подходящим для этой цели проникающим катионом будет являться родамин Б. Изучение зависимости скорости транслокации проникающего иона от длины алкильного хвоста может пролить свет на понимание механизмов проницаемости соединений разной гидрофобности через липидные мембраны, в том числе жирных кислот и неэлектролитов. Настоящий проект направлен на изучение механизма проницаемости гидрофобных ионов с делокализованным зарядом и их конъюгатов с различными веществами через липидные мембраны. Изучение будет проводиться на модельных плоских бислойных липидных мембранах и липосомах.
-
Научный задел:
В нашей лаборатории удалось успешно применить разработанную ранее методику измерения релаксации тока через БЛМ в ответ на прикладывание скачка разности потенциалов в присутствии проникающих ионов. С помощью этого метода мы изучили проницаемость серии соединений, являющихся конъюгатами проникающих катионов и антиоксидантов (Rokitskaya 2008). Впервые были определены константы скорости трансмембранной диффузии для производных трифенилфосфония. Показано, что конъюгаты включающие родаминовую группировку (родамин 19 и Б), проникают через липидные мембраны быстрее других. Нам удалось показать, что производные проникающих катионов являются переносчиками некоторых анионов, таких как жирные кислоты (пальмитат, олеат), карбоксифлуоресцеин (Rokitskaya 2010, Severin 2010). Было обнаружено, что производные родамина 19 (алкилированные аналоги и конъюгат с пластохиноном) обладают протонофорным действием на модельных липидных мембранах, митохондриях и дрожжах (Antonenko 2011). С помощью метода измерения релаксации тока мы впервые изучили механизмы действия катионного протонофора (на основе молекулы родамина 19) на липидных мембранах, измерили константы скоростей реакции трансмембранной диффузии (Rokitskaya 2013). Было показано, что замена сложноэфирных связей фосфолипидов на простые эфиры существенно ускоряет транслокацию гидрофобных катионов через БЛМ (Ильясова 2012, Rokitskaya 2013). Эти результаты объясняются существенным снижением скачка дипольного потенциала мембраны (около 100 мВ) при отсутствии карбонильных групп сложноэфирных связей, диполи которых вносят значительный вклад в формирование дипольного потенциала мембраны. Также мы исследовали способность борированных производных хлорина е6 и порфирина, являющихся моно-, ди- или тетраанионами проникать через липидные мембраны (Moisenovich 2010, Рокицкая 2012). Оказалось, что все эти соединения хорошо проникают через мембраны даже несмотря на наличие у некоторых нескольких зарядов.
- Добавил в систему: Рокицкая Татьяна Ивановна
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Изучение механизма проницаемости гидрофобных ионов с делокализованным зарядом и их конъюгатов через бислойные липидные мембраны |
| Результаты этапа: Для изучения механизмов проницаемости гидрофобных ионов с делокализованным зарядом и их алкилированных производных через модельные липидные мембраны в 2015 году были синтезированы этиловый, н-бутиловый, н-октиловый и н-додециловый эфиры родамина Б. С помощью метода измерения релаксации электрического тока через плоские бислойные липидные мембраны в ответ на прикладывание разности потенциала была изучена транслокация этих соединений через гидрофобный слой мембраны. Было обнаружено, что для всех используемых липидов константа скорости трансмембранной диффузии производных родамина Б через липидную мембрану растет с увеличением длины алкильной цепи для короткоцепочечных соединений (этиловый, бутиловый и октиловый эфиры) и практически не меняется для производных с более длинной алкильной цепью (н-додециловый и н-октадециловый эфиры). Скорость трансмембранной диффузии существенно зависела от используемого липида и уменьшалась в следующей последовательности: дифитанилфосфатидилхолин > диолеилфосфатидилхолин > дифитаноилфосфатидилходин > диерукоилфосфатидилхолин. На основании этих данных мы оценили разницу скачка дипольного потенциала для диолеилфосфатидилходина, дифитаноилфосфатидилхолина и диерукоилфосфатидилхолина относительно дифитанилфосфатидилхолина, и она составила 88, 107 и 120 мВ, соответственно. Эти результаты подтверждают выводы других авторов, что липиды с ненасыщенными двойными связями имеют меньший скачок дипольного потенциала на границе раздела фаз. Нами была предложена модель, объясняющая влияние длины алкильной цепи производных родамина Б на константу скорости их транслокации через липидную мембрану. Она учитывает существование крутого профиля свободной энергии погружения метиленовой группы на границе раздела фаз мембрана – вода. Модель предполагает, что для коротких алкилов увеличение цепи на одну метиленовую группу приводит к уменьшению потенциального барьера для проникновения благодаря вкладу энергии гидрофобности. В случае длинных алкилов увеличение цепи не приводит к изменению потенциального барьера трансмембранного проникновения из-за значительного заглубления алкильной цепи в мембране. | ||
| 2 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Изучение механизма проницаемости гидрофобных ионов с делокализованным зарядом и их конъюгатов через бислойные липидные мембраны |
| Результаты этапа: Способность митохондриально-направленных антиоксидантов, представляющих собой хинонную группу, ковалентно пришитую через углеводородный линкер к липофильному катиону трифенилфосфонию, переносить электроны через биологические мембраны и тем самым опосредовать трансмембранные редокс процессы не изучалась ранее. Для исследования этого процесса мы использовали методику измерения скорости восстановления феррицианида, заключенного в липосомы, в присутствии внешнего аскорбата. Мы показали, что митохондриально-направленные антиоксиданты, содержащие убихинонил (MitoQ серия) и пластохинонил (SkQ серия), могут переносить электроны через липидные мембраны. Скорость переноса электронов оказалась обратно пропорциональна длине углеводородной линкерной группировки конъюгата. Этот процесс ускорялся в присутствии гидрофобного аниона тетрафенилбората, из чего можно предположить, что проникновение катионного антиоксиданта через мембрану является лимитирующей стадией переноса электронов. Этот вывод подтвердился наблюдением того, что скорость переноса электронов, индуцированная митохондриально-направленными антиоксидантами, не зависела от добавления нигерицина, в отличие от переноса электронов, индуцированного нейтральными производными хинонов. Эти результаты означают, что митохондриально-направленные антиоксиданты могут использоваться в качестве переносчиков электронов через липидные мембраны, а также применяться для изучения электрон-транспортной цепи в митохондриях и других природных мембранах, демонстрирующих редокс процессы. Нами было обнаружено, что орто-карборан (1,2-C2B10H12) является переносчиком протонов как в митохондриальной так и в искусственной липидной мембране. Это подразумевает, что дикарборан может обратимо депротонироваться и диффундировать через мембрану в нейтральной и анионной формах. Как и известные разобщители (например, динитрофенол) о-карборан ускоряет митохондриальное дыхание и уменьшает мембранный потенциал в концентрациях порядка десятков микромолей. Протонофорная активность о-карборана была показана флуорометрическими измерениями на липосомах, нагруженных пиранином, и измерениями электрического тока через плоскую липидную мембрану. Протонная проводимость мембраны в присутствии о-карборана была подтверждена образованием разности потенциалов нулевого тока при создании градиента рН на мембране. Мета-карборан (1,7-C2B10H12) не обладал протонофорной активностью в соответствии с его более низкой С-Н кислотностью. Результаты этой работы предполагают, что слабые С-Н кислоты могут проявлять протонофорную активность в биологических объектах. Фуллеренолы – водорастворимые аналоги фуллеренов – проявляют как антиоксидантные так и прооксидантные свойства в модельных и биологических системах. Мы впервые показали, что фуллеренол C60(OH)24 индуцирует ионную проводимость плоских бислойных липидных мембран посредством образования ионных пор или проводящих дефектов с преобладанием катионной проводимости. Фуллеренол-индуцированный электрический ток нелинейно зависел от концентрации и обратимо увеличивался при защелачивани водного раствора. Ионы кальция и магния уменьшали проводимость мембраны, опосредованную фуллеренолом. C60(OH)24 не приводил к выходу карбоксифлуоресцеина из липосом, что говорит о небольшом размере индуцированных им пор. В отличие от ионной проводимости связывание фуллеренола увеличивалось при кислых рН, что измерялось по тушению флуоресценции пирен-меченного липида. В соответствии с этим фотодинамическое действие фуллеренола на пептид грамицидин А в липидной мембране также увеличивалось при низких рН. Предполагается, что агрегаты C60(OH)24 могут стабилизировать проводящие липидные дефекты. | ||
| 3 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Изучение механизма проницаемости гидрофобных ионов с делокализованным зарядом и их конъюгатов через бислойные липидные мембраны |
| Результаты этапа: Для изучения механизмов проницаемости гидрофобных ионов с делокализованным зарядом и их алкилированных производных через модельные липидные мембраны нами были синтезированы этиловый, н-бутиловый, н-октиловый и н-додециловый эфиры родамина Б. С помощью метода измерения релаксации электрического тока через плоские бислойные липидные мембраны в ответ на прикладывание разности потенциала была изучена транслокация этих соединений через гидрофобный слой мембраны. Было обнаружено, что для всех используемых липидов константа скорости трансмембранной диффузии производных родамина Б через липидную мембрану растет с увеличением длины алкильной цепи для короткоцепочечных соединений (этиловый, бутиловый и октиловый эфиры) и практически не меняется для производных с более длинной алкильной цепью (н-додециловый и н-октадециловый эфиры). Способность митохондриально-направленных антиоксидантов, представляющих собой хинонную группу, ковалентно пришитую через углеводородный линкер к липофильному катиону трифенилфосфонию, переносить электроны через биологические мембраны и тем самым опосредовать трансмембранные редокс процессы не изучалась ранее. Для исследования этого процесса мы использовали методику измерения скорости восстановления феррицианида, заключенного в липосомы, в присутствии внешнего аскорбата. Мы показали, что митохондриально-направленные антиоксиданты, содержащие убихинонил (MitoQ серия) и пластохинонил (SkQ серия), могут переносить электроны через липидные мембраны. Скорость переноса электронов оказалась обратно пропорциональна длине углеводородной линкерной группировки конъюгата. Этот процесс ускорялся в присутствии гидрофобного аниона тетрафенилбората, из чего был сделан вывод, что проникновение катионного антиоксиданта через мембрану является лимитирующей стадией переноса электронов. Эти результаты означают, что митохондриально-направленные антиоксиданты могут использоваться в качестве переносчиков электронов через липидные мембраны, а также применяться для изучения электрон-транспортной цепи в митохондриях и других природных мембранах, демонстрирующих редокс процессы. Измерив релаксации электрического тока в ответ на прикладывание скачка разности потенциала, мы определили константы скорости проникновения делокализованного аниона бисдикарболлида кобальта (COSAN) и четырех его галогенированных аналогов: 8,8’-F2, 8,8’-Cl2, 8,8’–Br2 и 8,8’–I2 производных. Было показано, что скорость транслокации через липидную мембрану большинства галогенированных производных бисдикарболлида кобальта увеличивается с ростом молекулярного веса галогена и объемом молекулы. Исключение составляет фторированное производное, что, по-видимому, связано с цисоидной конформацией (дипольный момент 5.4 Д) этого аниона на поверхности мембраны. Мы предполагаем, что наличие дипольного момента у сорбированного аниона вносит дополнительный барьер для проникновения его через мембрану, так как в этом случае процесс транслокации должен содержать также вращение аниона для определенной ориентации на поверхности липидной мембраны. Было также обнаружено, что димеры алкилированных производных родамина 19 и родамина Б блокируют в микромолярных концентрациях ионную пору альфа-гемолизина. Время блокировки канала зависело от типа родамина и уменьшалось с увеличением гидрофобности соединения. С помощью изучения потенциал-зависимости закрывания поры удалось выявить область связывания димеров делокализованного катиона с каналом. Результаты этой работы говорят о возможном взаимодействии проникающих катионов с белками биологических мембран. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".