ИСТИНА

НИР посвящена комплексному анализу (ультраструктура, биология, молекулярная филогения)низших групп Alveolata с целью выявления путей эволюции, приведших к формированию всей группы в целом в современном виде

В течение 2009-2011 годов был собран и исследован материал, относящийся к неизученным или малоизученным ключевым группам Alveolata (Colponema spp. – 3 вида, Colpodella angusta), находящимся в основании ветви Myzozoa (Apicomplexa+Dinoflagellata), а также к представителям неизученных или малоизученных плезиоморфных таксонов Apicomplexa: Blastogregarinida (2 вида), Eugregarinida (6 видов), Archigregarinida (2 вида), Protococcidia (2 вида) и Digyalum oweni (Apicomplexa incertae sedis). Изучена ультраструктура 8 видов, прочитаны последовательности рибосомного оперона (18S+ITS1+5,8S+ITS2+28S рРНК) 10 видов, и только гена 18S рРНК у 6-ти видов. Полученные результаты являются новыми и, в основном, пионерными в сопоставлении с мировым уровнем: они вызвали интерес у ведущих зарубежных протистологов (в том числе и в плане подготовки совместных публикаций и проектов: ERA-NET). 1. Впервые прочитаны нуклеотидные последовательности рибосомного оперона четырёх образцов, относящихся к хищным жгутиконосцам – трём видам рода Colponema, и прочитана последовательность гена 18S рРНК хищного жгутиконосца Colpodella angusta. Результаты анализа этих данных говорят в пользу гипотезы первичной гетеротрофности Alveolata. Молекулярно-филогентический анализ показал, что один из видов кольпонем – Colponema marisrubri, занимает базальное положение по отношению ко всем Alveolata, а два других – Colponema edaphicum и Colponema sp. из Перу – формируют парафилетическую группу, от которой берут начало Myzozoa (Dinoflagellata+Apicomplexa, включая кольподеллид). Таким образом, кольпонемы оказываются неоднородными, и, похоже, действительно являются анцестральной группой, давшей в прошлом начало всему разнообразию Alveolata. Филогенетический анализ представители рода Colpodella по генам 18S и 28S РНК показывает, что по первому гену кольподеллиды являются базальной ветвью Apicomplexa, а по второму - базальной ветвью динофлагеллят. Такая неоднозначность указывает на то, что возможно кольподеллиды является общими предками обеих этих групп. 2. Впервые получены данные по ультраструктуре и прочитаны нуклеотидные последовательности рибосомного оперона двух плезиоморфных таксонов Apicomplexa: бластогрегарин (2 вида) и протококцидий (2 вида). На основе комплексного анализа ультраструктуры и генов рибосомных РНК показано, что бластогрегарины представляют собой самостоятельную кладу споровиков, проявляющую родство с кокцидиями, но обладающие плезиоморфной морфологией, сходной с архигрегаринами. Морфологические особенности протококцидии Eleutheroschizon duboscqui паразитизм в паразитофорном мешке, формирование прикрепительных органелл) роднят его с Cryptosporidium. Молекулярно-филогенетический анализ показал, что Protococcidia – полифилетический таксон. Вид Coelotropha durchoni группируется с Coccidia, но не с Eimeriida или Adeleida, а с изолированной кладой Aggregata spp. Их сестринская группа – агамококцидии Rhytidocystis spp., которые ранее занимали неопределенное положение с тенденцией ассоциации с грегаринами. E. duboscqui не может быть характеризован однозначно: “NJ” помещает его как базальную ветвь к Coelotropha-Aggregata. Однако используя более точный метод “BI”, этот вид неожиданно оказывается среди Сolpodellida, а не Sporozoa. То есть, этот вид не объединяется ни с Coccidia, ни к Cryptosporidia, как это можно было ожидать, основываясь на жизненном цикле и способе паразитизма, а оказывается более плезиоморфным, чем любой другой известный организм со “спорозойным” жизненным циклом. 3. Прочитаны нуклеотидные последовательности 18S рРНК двух видов архигрегарин из залива Восток Японского моря (хозяева полихеты Stylaroides plumosus и Polydora glycimerica) и, впервые для этой группы споровиков, последовательность рибосомного оперона (18S+ITS1+5,8S+ITS2+28S рНК) архигрегарины Selenidium sp. из кишечника полихеты Pygospio elegans с Беломорской биостанции МГУ. Изучена ультраструктура этих организмов. Молекулярные данные показывают, что беломорский и один из дальневосточных образцов относятся к одному виду, а также, что все эти виды объединяются вместе с тремя другими и образуют относительно длинную ветвь внутри достаточно разнородной группы архигрегарин. 4. Прочитана последовательность гена 18S рРНК грегариноподобного организма Digyalum oweni: вместе с несколькими последовательнастями из окружающей среды она образует базальную ветвь к Platyproteum. vivax+Filipodium phascolosomae. До сих пор эта клада занимала неопределённое положение внутри Alveolata по причине исключительно длинных ветвей. Присоединение D. oweni как относительно короткой базальной ветви не привело к объединению с какими-либо архигрегаринами, с которыми эти организмы имеют общие черты, или другими ветвями споровиков. Полученные данные позволяют предположить, что все эти организмы представляют отдельную ветвь Sporozoa, сохраняющую некоторые общие для споровиков плезиоморфные черты строения. 5. Изучена ультраструктура эугрегарин Difficilina cerebratuli, Ancora sagittata, Bothriopsides histrio и двух видов грегарин из кишечника ракообразных: Cephaloidophora communis и Heliospora longissima. Прочитаны нуклеотидные последовательности 18S рРНК двух видов эугрегарин из целома полихеты Travisia forbesii: Urospora: U. travisiae и U. ovalis, получены последовательности 18S рРНК. Обнаружено, что поверхность этих грегарин покрыта эпицитарными гребнями, характерными для большинства Eugregarinida, что резко отличает их от представителя того же рода - U. chiridotae, чья поверхность покрыта цитопилями и лишена гребней. Предварительный анализ показал, что они располагаются в кладе, объединяющей семейства Lecudinoidae и Urosporidae (“Lecudinoidea”). Прочитаны рибосомные опероны грегарин из ракообразных: Cephaloidophora communis и Heliospora longissima. Проведён молекулярно-филогенетический анализ грегарин из ракообразных. Показано, что грегарины из ракообразных (кроме Porospora gigantea), во-первых, формируют чёткую самостоятельную кладу внутри грегарин (Cephaloidophoroidea), и, во-вторых, к этой кладе относятся многие неидентифицированные последовательности из окружающей среды (образцы из морских и пресноводных местообитаний), которые ранее аннотировались как независимые эволюционные ветви эукариот. Прочитана последовательность гена 18S рРНК грегарины из омара Porospora gigantea: она образует длинную ветвь, сестринскую Cephaloidophoroidea, ответвляясь ближе к основанию этой клады. Прочитан рибосомный оперон эугреарины Ancora sagittata, относимой к семейству Lecudinidae: она объединяется по гену 18S рРНК с примерно 14-ю неидентифицированными последовательностями эукариот, выделенными из окружающей среды, и вместе с ними в качестве сестринской группы не с другими лекудинидами, а с кладой неидентифицированных последовательностей среди которых клоны, выделенные из морских осадков и фораминифер (возможно, проглотивших ооцисты грегарин). Ранее систематическое положение этих клонов было загадочным из-за низких уровней поддержек при разрешении порядка ветвления филогенетического дерева споровиков. Теперь стало ясно, что это представители эугрегарин. Проведён молекулярно филогенетический анализ Eugregarinida по гену 18S рРНК, показавший наличие нескольких хорошо обособленных филогенетических группировок эугрегарин:“Actinocephaloidea”. “Lecudinoidea”, “Ancoroidea”, “Gregarinoidea” “Cephaloidophoroidea” Взаимоотношения между ними неясны, причиной этой неопределенности, возможно, является взрывной (“star-like”) характер возникновения линий эгрегарин с последующей быстрой эволюцией гена 18S рРНК, приведшей к образованию «длинных ветвей» на филогенетическом дереве. Предлагается изменить взгляд на систематику отряда Eugregarinida: существующие подотряды Aseptata и Septata следует упразднить, а взамен сгруппировать эугрегарин по надсемействам, соответствующим перечисленным выше группировкам на молекулярном дереве. 6. Проведён комплексный филогенетический анализ ), включающий в себя кладистический анализ Apicomplexa по «традиционным» признакам (морфология, жизненные циклы) и молекулярно-филогенетический анализ по генам рибосомных РНК, прежде всего, 18S. Предложена реконструкция облика общего предка споровиков и схема эволюции Apicomplexa, предполагающая почти одновременное появление сразу нескольких (больше чем две традиционно различающихся – грегарины и кокцидии) самостоятельных быстро эволюционирующих ветвей споровиков, из которых только архи- и бластогрегарины остались в состоянии морфостазиса. 7. Побочный результат: впервые получены последовательности гена SSU рРНК 4-х видов микроспоридий семейства Metchnikovellidae – гиперпаразитов грегарин. Они группируются в кладу, занимающую базальное положение на филогенетическом дереве микроспоридий. Мировая база данных по иным чем 18S рРНК генам в отношении низших Alveolata очень бедна (в GenBank (NCBI) имеются лишь 2 последовательности 28S рРНК грегарин). Полученные в ходе данного проекта данные позволят пополнить эту базу и, в перспективе, сравнить результаты филогенетического анализа разных рибосомных генов альвеолят, а также приблизить возможность мультигенного филогенетического анализа.