ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Проект направлен на получение новых знаний о строении теломерного хроматина и путях регуляции длины теломер. Теломеры – особые структуры на концах хромосом, состоящие из коротких повторов ДНК и связанных с ними белков. Теломерная ДНК теряется при каждом раунде репликации. Восстановление теломерных повторов необходимо для жизнедеятельности многих типов клеток (в том числе раковых). В ходе проекта планируется изучать функции биомолекул, ассоциированных с теломерными повторами, и исследовать механизмы регуляции синтеза теломерной ДНК.
The project is devoted to the research on telomere chromatin and pathways of telomere length regulation. Telomeres are specialized structures at the ends of the chromosomes, which consist of the short DNA repeats and associated proteins. Telomeres lose its DNA during each round of replication. Replenishment of telomere repeats is necessary for proliferation of many cell types (including cancer cells). During this project we plan to study functions of biomolecules associated with telomere repeats and investigate mechanisms of telomere DNA synthesis.
Мы планируем проверить возможность того, что теломерная локализация HpRif1 обусловлена узнаванием теломерной ДНК его N-концевым доменом. Планируется изучить специфичность связывания теломерной ДНК in vitro. Планируется измерить длину теломер в штаммах дрожжей, экспрессирующих либо только N-концевой домен HpRif1, либо HpRif1 без этого домена. Планируется провести структурные исследования N-домена HpRif1 и произвести поиск мутаций, нарушающих взаимодействие N-домена с ДНК in vitro и in vivo. Также мы планируем исследовать механизм ингибирующего влияния HpRif1 на теломеразу. Планируется создание штамма с совместной делецией киназ Mec1 и Tel1, чтобы подтвердить или исключить вероятность того, что их теломерные функции перекрываются в H. polymorpha. В случае обнаружения участия Mec1 (либо Mec1 и Tel1 одновременно) – проверить возможность ингибирования теломерной локализации этих киназ белком Rif1. Планируем изучение белков, связанных с двуцепочечной частью теломер. Разработать методику экспрессии и выделения белков HpRap1A и HpRap1B в рекомбинантной форме. Изучить ДНК-связывающие свойства каждого из этих белков in vitro. Планируется также проверить, увеличится ли количество HpRap1A на теломерах в штамме, в котором отсутствует HpRap1B. Нами планируется провести поиск нуклеотидного остатка, при замене которого HpRap1A перестанет узнавать ДНК. При обнаружении такого нуклеотида – создать штамм с мутацией в теломерах и измерить их длину. Если в процессе исследования выяснится, что белок HpRif1 предпочтительно ассоциирует с двуцепочечной частью теломер, то планируется проверить влияние HpRap1A и HpRif1 на теломерную локализацию друг друга. Мы собираемся изучить белки, ассоциированные с одноцепочечной частью теломер H. polymorpha. Экспериментально проверить присутствие найденного ранее гомолога HpCdc13 в составе теломерного хроматина. Разработать методику его экспрессии и выделения в рекомбинантной форме. Создать штамм с делецией этого белка и проверить влияние на длину теломер. Планируется исследовать возможность активации теломеразы H. polymorpha по механизму, связанному с взаимодействием Cdc13 с теломеразным комплексом. Если окажется, что HpRif1 имеет большее сродство к оцДНК теломер, то проверить влияние HpCdc13 на выполнение функций HpRif1.
В лаборатории освоены методы культивирования и генетических манипуляций для дрожжей H. polymorpha. Для этого организма нами определены многие компоненты теломерного хроматина и теломеразного комплекса. Были адаптированы методы иммуннопреципитации хроматина и измерения длины теломер. Разработаны методики выделения некоторых рекомбинантных белков H. polymorpha в виде пригодном для структурных исследований. В ходе работы в лаборатории обнаружено уникальное свойство теломеразной РНК H. polymorpha, приводящее к ограничению регуляции длины теломер посредством обратной транскрипции последнего нуклеотида матричного участка [Smekalova EM, Malyavko AN, Zvereva MI, Mardanov AV, Ravin NV, Skryabin KG, Westhof E, Dontsova OA. (2013), RNA, 19 (11).].
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 11 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Строение и регуляция длины теломер |
Результаты этапа: Планы на 2017 выполнены в полной мере. Мы оценили сродство N-концевого домена Rif1 (NRif) к разным ДНК-субстратам in vitro. Обнаружено, что NRif обладает некоторым предпочтением к одноцепочечной теломерной ДНК по сравнению с двуцепочечной ДНК, но это свойство маскируется значительной степенью неспецифического связывания. Подтверждён экспериментально факт отсутствия выраженной вторичной структуры у N-концевого домена Rif1. Измерена длина теломер в штамме с удалённым N-концевым доменом Rif1. Теломеры в таком штамме удлиняются по сравнению со штаммом дикого типа. В то же время они не становятся такими же длинными, как в штамме с удалённым геном RIF1. Это говорит о том, что N-концевой домен необходим для выполнения функций Rif1, но не является полностью критическим компонентом белка. Также мы измерили длину теломер в штамме NRif-НА. В этом штамме теломеры оказались той же длины, что и в rif1. Значит, ингибирующей теломеразу функции у этого домена нет, и по всей видимости он нужен только для привлечения Rif1 на теломеры. Найдены аминокислотные остатки, замена которых приводит к потере взаимодействия NRif с ДНК in vitro. Проверено, что внесение таких замен в Rif1 приводит к снижению его ассоциации с теломерами и их удлинению. Таким образом, за первый год выполнения проекта мы проверили возможность того, что Rif1 привлекается на теломеры H. polymorpha за счёт взаимодействия его N-концевого домена с теломерной ДНК напрямую. Мы получили ряд подтверждений данной гипотезе, однако на основании полученных за первый год проекта результатов трудно сделать однозначный вывод о том, что именно ДНК-связывающая активность N-концевого домена обеспечивает теломерную локализацию Rif1, поэтому мы решили провести дополнительные эксперименты по установлению функции N-концевого домена Rif1. | ||
2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Строение и регуляция длины теломер |
Результаты этапа: В 2018 году мы изучили белки, предположительно связанные с двуцепочечной частью теломер H. polymorpha – Rap1A и Rap1B. Мы получили оба белка в рекомбинантной форме и изучили специфичность узнавания ДНК белками in vitro. Полученные результаты показали, что Rap1B связывает теломерные повторы, а Rap1A – связывается с коротким сайтом в субтеломерной области H. polymorpha. Были определены константы, характеризующие взаимодействие белков Rap1A и Rap1B с теломерными ДНК из различных видов дрожжей, что позволило сделать вывод о том, что Rap1A и Rap1B имеют различную специфичность к ДНК субстратам. При помощи гель-шифт метода мы проверили полученный ранее штамм deltarap1B. Оказалось, что белок Rap1B всё-таки присутствует, т.е. штамм не является нокаутным. Тогда для того, чтобы выявить потенциальное влияние Rap1B на длину теломер, мы получили штаммы с делециями С-концевых аминокислот Rap1B и обнаружили, что такие мутации приводят к удлинению теломер (преимущественно за счёт рекомбинации теломерной ДНК). Мы создали штамм moxNRif-HA, в котором экспрессия тагированного NRif находилась под контролем сильного индуцируемого промотора гена метанол-оксидазы (MOX), нативный локус Rif1 при этом оставался целым. Анализ длины теломер в таком штамме показал, что NRif-HA не способен вытитровать Rif1 с теломерной ДНК в клетках, даже когда он находится в избытке по сравнению к Rif1. Значит, N-концевой домен Rif1 по всей видимости не является самостоятельным модулем привлечения Rif1 на теломеры и для прочного взаимодействия нужны дополнительные участки белка. Мы также исследовали возможность того, что для активации теломеразы на теломерах необходима киназа Mec1. Мы обнаружили, что в штамме mec1 теломеры немного короче, чем в штамме дикого типа. Следовательно, ингибирующее действие Rif1 на теломеразу может быть опосредовано киназой Mec1 – гипотеза, которую мы планируем проверить в следующем году. | ||
3 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Строение и регуляция длины теломер |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".