ИСТИНА

Согласно современным взглядам, в среднем у взрослого человека 10^11 кровеносных сосудов, 99 % которых относятся к системе микроциркуляции. Через проницаемые стенки капилляров происходит обмен веществ между тканевой жидкостью и плазмой крови. Исследование капилляров ногтевого ложа человека известно достаточно давно. До недавнего времени они носили характер наблюдений: количественные измерения начали использоваться с появлением телевизионной и компьютерной техники. Результаты исследования микроциркуляции крови с использованием методики цифровой капилляроскопии ногтевого ложа при таких социально значимых заболеваниях как артериальная гипертензия, сахарный диабет или хроническая сердечная недостаточность показали, что эта технология может предоставить врачу весьма значимую информацию о состоянии микрососудистого русла и окружающих его тканей. Выявление таких параметров как снижение плотности капиллярной сети, ремоделирование микрососудистого русла, количественная оценка степени выраженности отечного синдрома, определение скорости капиллярного кровотока, - это та ценная для врача информация, которую невозможно получить другими методами, не причиняя пациенту каких либо болезненных ощущений или дискомфорта. В то же время, существующие методы носят характер точечных измерений, чаще всего используются в научных целях. Более того, имеющиеся методы оценки параметров микроциркуляции основаны на феноменологических закономерностях, тогда как понимание сопутствующих процессов на молекулярном уровне отсутствует. В данном проекте предлагается выполнение комплексного исследования параметров соединительной ткани (эпидермиса и папиллярного дермиса ногтевого ложа) с целью обоснования подхода к персонализированной диагностике сердечной недостаточности с использованием мобильной капилляроскопии. Исследование структуры ткани вокруг капилляров ногтевого ложа (кровотока в режиме in vivo, белков соеднительной ткани (коллагена и эластина), морфологии клеток эпидермиса и др.) будет производиться с использованием метода двухфотонной томографии, успешно примененного нами для исследования сосудов и папиллярного дермиса (Shirshin et al., Scientific Reports, 2017). В рамках проекта планируется применить ряд нелинейно-оптических методов для исследования клеток крови и тканей периваскулярной зоны, среди которых основное значение для проекта составляет многофотонная томография (МФТ) и флуоресцентная время-разрешённая микроскопия (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM), позволяющая визуализировать отдельные типы молекул, используя различия во временах жизни их возбужденных состояний. В результате, будут на молекулярном уровне исследованы процессы, лежащие в основе чувствительности параметров, измеряемых с помощью оптической капилляроскопии, к нарушениям функционирования сердечно-сосудистой системы.

According to modern views, an average adult has ~10^11 blood vessels, 99% of which are involved into microcirculation. Through the permeable walls of the capillaries, there is a metabolism between the tissue fluid and the blood plasma. Investigation of the capillaries of the human nail bed has been known for a long time. Until recently, the research in the area of capillaroscopy was phenomenological and sparse. Quantitative capillaroscopic measurements began to be used with the advent of imaging and computer technology. The results of a study of blood microcirculation using the method of digital capillaroscopy of the nail bed for such socially significant diseases as hypertension, diabetes mellitus or chronic heart failure showed that this technique can provide the doctor with very significant information about the state of the microvascular bed and surrounding tissues. Identification of such parameters as a decrease in the density of the capillary network, remodeling of the microvascular bed, quantification of the degree of the edematous syndrome, determination of the rate of capillary blood flow is that valuable information for the doctor that can not be obtained by other methods without causing the patient any painful sensations or discomfort. At the same time, existing methods are mainly focused at single measurements and are mainly used for scientific purposes. Moreover, the available methods for estimating the parameters of microcirculation are based on phenomenological facts, whereas there is no understanding of the concomitant processes at the molecular level. In this project, a complex study of the parameters of connective tissue (epidermis and papillary dermis of the nail bed) is proposed with the aim of substantiating the approach to personalized diagnosis of heart failure using mobile capillaroscopy. A study of the tissue structure around the capillaries of the nail bed (in vivo blood flow, connective tissue proteins (collagen and elastin), epidermal cell morphology, etc.) will be performed using the two-photon tomography technique successfully used for the study of blood vessels and papillary dermis (Shirshin et al. Al., Scientific Reports, 2017). Within the framework of the project, it is planned to apply a number of nonlinear optical methods for the study of blood cells and tissues of the perivascular zone, among which the main importance for the project is multiphoton imaging (MPT) and Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), which allows visualizing individual types of molecules, using the differences in the lifetimes of their excited states. As a result, the processes underlying the sensitivity of parameters measured by optical capillaroscopy to cardiac dysfunction will be investigated at the molecular level.

В рамках проекта будут получены следующие основные результаты: - с помощью метода двухфотонной томографии будут исследованы параметры периваскулярной зоны. На основании полученных данных будет выявлена взаимосвязь между молекулярными параметрами ткани периваскулярной зоны и индикаторами сердечной недостаточности (конкретно, будет исследована возможность измерения диффузии плазмы крови через стенки капилляров (по сути, отечности) с целью диагностики сердечной недостаточности и динамики ее лечения). Недавно метод МФТ был впервые применен нами для исследования капилляров и периваскулярной зоны на человеке in vivo (Shirshin et al., Scientific Reports, 2017), при этом было показано, что с помощью метода FLIM становится возможным выделить вклад от содержимого капилляров (эритроцитов и плазмы крови), их стенки, а также от белков периваскулярной ткани (коллагенов и эластина), - С помощью метода FLIM путём измерения автофлуоресценции клеточных компонентов (NAD(P)H, FAD и гемоглобина) при двухфотонной накачке будут исследованы (1) спектральные характеристики двухфотонного возбуждения и эмиссии эритроцитов in vitro (модельные эксперименты) и in vivo; (2) процессы фотоповреждения клеток под действием двухфотонной накачки; (3) процессы деградации эритроцитов при их инкубации в физрастворе и плазме крови; (4) возможность разделения окси- и дезоксигемоглобина. В результате будут исследованы возможности МФТ в in vivo цитометрии, в частности, в визуализации агрегатов эритроцитов в потоке (принципиальная возможность показана недавно в работе (Wu, C. H., Wang, T. D., Hsieh, C. H., Huang, S. H., Lin, J. W., Hsu, S. C., ... & Liu, T. M. (2016). Imaging Cytometry of Human Leukocytes with Third Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports, 6.)) - будет разработана методика автоматического анализа изображений, полученных методом видеокапилляроскопии, и определения параметров капилляров и периваскулярной зоны для создания методики скрининговой диагностики социально значимых заболеваний. Разработка автоматизации подобной методики в настоящее время стала возможной благодаря развитию методов обработки изображений с использованием методов машинного обучения и нейросетевых алгоритмов. Автоматизированное определение патологии по параметрам микрососудов (капилляров) и периваскулярной зоны позволит внедрить данную методику в клиническую практику и значительно увеличить статистическую выборку, лежащую в основе метода оптической капилляроскопии, - будут проведены исследования динамики изменения параметров периваскулярной зоны на пациентах, к которым применяется инфузионная терапия (on-line мониторинг жидкости в тканях), антиагреганты, лекарства, влияющие на параметры венозного и артериального отделов капилляров и др. - с помощью алгоритмов распознавания изображений на основе методов машинного обучения будет разработана методика анализа лейкоцитов (in vivo цитометрии) по данным флуоресцентной капилляроскопии (визуализация клеток будет проводиться по флуоресценции их комплексов с красителем либо по автофлуоресценции). В результате выполнения проекта будут выявлены научно-обоснованные (путем исследования с использованием МФТ процессов на молекулярном уровне) параметры микроциркуляции и периваскулярной ткани, которые являются индикаторами сердечно-сосудистых патологий, могут легко измеряться мобильными капилляроскопами с автоматическим анализом изображения и использоваться для персонализированной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и мониторинга динамики лечения.

Руководитель проекта является руководителем группы лазерной биофотоники кафедры квантовой электроники физического факультета МГУ и специализируется в области оптической диагностики биологических систем. В последнее время акцент исследований сместился на применение полученного задела к in vivo диагностике тканей (прежде всего, кожи) с использованием флуоресцентной спектроскопии, в том числе, метода FLIM. Исследования, проведенные совместно с Центром дерматологии (клиника Шарите, Германия) показали перспективность применения FLIM для визуализации капилляров и диагностики их содержимого, а также локализации белков (коллагенов типа I и III, а также эластина) в дерме – часть результатов была недавно опубликована в журнале Scientific Reports. Задачи, которые ставятся в данном проекте, являются продолжением начатых исследований в области многофотонной томографии (МФТ) кожи. На данный момент, установка для МФТ на базе конфокального микроскопа Nikon A1R MP запущена в ЦИТО им. Приорова, при этом она позволяет выполнять исследования ткани ногтевого ложа и папиллярного дермиса. Полученные в ходе сотрудничества результаты послужили стимулом к формулировке задач данной заявки. В частности, в рамках исследования 120 больных с сердечной недостаточностью, проведенного на базе НКЦ РЖД (группа д.м.н. Гурфинкеля Ю.И.), были проведены измерения ряда параметров с помощью эхокардиографии, оптической капилляроскопии, биохимических анализов и других методов (всего измерялось до 49 параметров для каждого пациента). В результате анализа полученных данных нами было установлено, что размер периваскулярной зоны является наиболее значимым индикатором стадии сердечной недостаточности с чувствительностью и селективностью (82% и 85%, соответственно), превышающими чувствительность и селективность фракции выброса (62% и 82%).