ИСТИНА

Бета-лактамные антибиотики, к которым относятся пенициллины, цефалоспорины, монобактамы и карбапенемы, являются наиболее широко используемым классом антибактериальных средств для лечения инфекций. Основным фактором, ограничивающим клиническую эффективность бета-лактамных антибиотиков, является способность микроорганизмов вырабатывать гидролитические ферменты бета-лактамазы, разрушающие структуру антибиотика. Ингибирование данных ферментов является в настоящее время наиболее перспективным способом преодоления резистентности бактерий к антибиотикам данного класса. Целью проекта является поиск новых эффективных ингибиторов бета-лактамаз на основе знания детальной структуры ферментов и их комплексов с потенциальными ингибиторами с целью повышения эффективности антибактериальной терапии инфекционных заболеваний. Для скрининговых исследований эффективности новых ингибиторов будет создан биобанк рекомбинантных форм бета-лактамаз. Для этого будут получены штаммы-продуценты рекомбинантных бета-лактамаз различных типов.

В результате выполненной работы был создан биобанк рекомбинантных форм бета-лактамаз молекулярных классов A, B и D. II. Разработаны методики определения кинетических констант и констант ингибирования на основе хромогенного субстрата CENTA для изучения свойства рекомбинантных бета-лактамаз и скрининга новых потенциальных ингибиторов. Впервые определены каталитические параметры рекомбинантных бета-лактамаз CTX-M-2 и VIM-4 по субстрату CENTA. Полученные значения составили для рекомбинантной бета-лактамазы CTX-M-2: KM = 78 ± 3 мкM, Vмакс = 17,0 ± 0,5 мкM/с, kкат = 1315 ± 40 с-1; для рекомбинантной бета-лактамазы VIM-4: KM = 410 ± 30 мкМ, Vмакс = 10 ± 1 мкM/с, kкат = 240 ± 20 с-1. Определены каталитические параметры рекомбинантной бета-лактамазы TEM-1 (KM = 22 ± 2 мкM, Vмакс = 0,38 ± 0,02 мкM/с, kкат = 30 ± 2 с-1). Определены значения констант ингибирования (KI) гидролиза субстрата CENTA для рекомбинантной бета-лактамазы TEM-1: KI(сульбактам) = 0,43 ± 0,15 мкM, KI(тазобактам) = 0,041 ± 0,008 мкM, KI(клавулановая кислота) = 0,06 ± 0,01 мкM). III. На основе разработанных методик совместно с группой д-ра Ламзина на базе ЕМБЛ в центре химической биологии в г. Гельдельберг (Германия) протестированы in vitro 550 индивидуальных различных химических соединений, предсказанных in silico, с использованием очищенного препарата рекомбинантной бета-лактамазы ТЕМ-1. Найдены 5 новых соединений обладающих высокой ингибирующей способностью по отношение к ТЕМ-1 бета-лактамазе, причём, одно из них обладало эффективностью более чем в 10 раз выше по сравнению с известными нековалентными ингибиторами бета-лактамаз. По результатам их способности подавлять рост бактерий для подробного кинетического анализа было отобрано одно производное (Nr-6922126). Это соединение тестировалось в качестве ингибитора бета-лактамаз впервые. Рассчитанная экспериментально константа ингибирования KI(Nr-6922126) составила 20 + 1 мкМ, что более чем в 20 раз превосходит известные в настоящее время ингибиторы бета-лактамаз, действующие алостерически. Разработаны оригинальные методики синтеза найденных потенциальных ингибиторов, а также их различных аналогов, содержащих заместители. Подтверждено ингибирующее воздействие тестируемого соединения (Nr-6922126), способного подавлять рост клеток E.coli, продуцирующих бета-лактамазу. Образцы высокочищенного препарата рекомбинантной бета-лактамазы ТЕМ-1 переданы зарубежному партнёру для кристаллизации с целью определения структуры фермента и комплексов предложенных ингибиторов с ферментом. Методом рентгено-структурного анализа была подтверждена структура рекомбинантной бета-лактамазы ТЕМ-1 с разрешением 2А, что превышает разрешение (2.7А) ранее депонированной в PDB 3JYI структуры при схожести кристаллической ячейки (6 молекул в ассиметрической ячейки со стороной 500A). Работа над получением кристаллической структуры комплекса фермент-ингибитор с целью установления их места локализации и механизма связывания с ферментом-мишенью продолжается. Учитывая высокую перспективность настоящего исследования по результатам совместного проекта через центр трансфера технологий ЕМБЛ подготовлена заявка на патент.