ИСТИНА

Цель и задача проекта заключается в том, чтобы исследовать возможности регуляции работы цитохром с оксидазы (ЦО) митохондрий через взаимодействие лигандов с консервативной амфипатической площадкой, расположенной вблизи устья протонного канала К. Группой Фергюсон-Миллер (Мичиганский университет) такая площадка была обнаружена в структуре субъединицы I бактериальной ЦО из Rhodobacter spaeroides и показано связывание с ней целого ряда детергентов, стероидов и родственных им соединений. В данном проекте предполагается провести исследования на цитохромоксидазе, выделенной из митохондрий сердца быка. Очевидно, что именно в митохондриях животных регуляторное взаимодействие со стероидами, тиреоидными гормонами и другими физиологически активными соединениями имеет особый смысл и должно быть наиболее актуально. Предлагаемое исследование преследует 2 основные задачи. Во-первых, выявить возможность прямой регуляции митохондриальной ЦО физиологически активными соединениями , включая стероидные и тиреоидные гормоны и структурно родственные им соединения.. Важность этой проблемы очевидна. Во-вторых, мы надеемся, что попутно удастся разрешить одну давнюю биохимическую загадку в энзимологии митохондриальной ЦО, известную почти с середины XX века. Известно, что некоторые детергенты, широко применявшиеся для выделения и очистки ЦО (например, Тритон X-100 или дезоксихолат) позволяют получить чистый однородный фермент, содержащий все субъединицы и простетические группы, однако, частично или практически полностью лишенный активности. Ингибирующее действие таких детергентов как Тритон Х-100 или дезоксихолат на активность ЦО может как раз объясняться их специфическим взаимодействием с амфипатической площадкой, контактирующей с каналом К, так что связывающийся лиганд стерически «пережимает» канал. Такой механизм действия может быть достаточно надежно проверен.

The aim of the project is to study the possibilities of regulation of mitochondrial cytochrome c oxidase (CcO) activity by interaction of ligands with a conserved amphipathic cavity near the entrance of proton channel K. Such a cavity accessible from the bulk aqueous phase has been discovered in the structure of catalytic subunit I of CcO from Rhodobacter sphaeroides by Fergusson-Miller group (Michigan State University) and was shown to bind various detergents, steroids and structurally related substances. In the current project we plan to study CcO isolated from mitochondria of bovine heart. It is obvious that regulatory effect of steroid and thyroid hormones and other physiologically active substances will make special sense and must be more actual. This study runs after two main goals. First, to reveal the possibility of direct regulation of CcO by physiologically active compounds including steroid and thyroid hormones and relative substances. Second, on the side we hope to solve an old biochemical problem associated with mitochondrial CcO and known almost since the middle of XX century. It is well established that some detergents used to isolate and purify CcO (e.g. Triton X-100 or deoxycholate) provide quite pure and homogenous enzyme containing all subunits and prosthetic groups but at the same time partly or completely inactive. Thus, inhibitory effect of such detergents like Triton X-100 and deoxycholate might be explained by its specific interaction with amphipathic cavity which is in contact with K channel so that bound ligand can sterically “grip” it. Such mechanism can be validated experimentally.

В 2017 году планировалось проверить действие на митохондриальную ЦО наиболее простых и активных соединений, которые, по данным группы Фергюсон-Миллер, вызывали ингибирование дыхания бактериальной ЦО. Таким образом предполагается отобрать соединения, способные потенциально взаимодействовать с консервативной амфипатической площадкой вблизи протонного канала К в каталитической субъединице I. Для соединений, проявляющих ингибиторную активность, планируется охарактеризовать ингибирование более подробно (определить С50 и максимальную степень ингибирования).

Подобрана группа детергентов и физиологически активных соединений, ингибирующих бычью ЦО и, видимо, связывающихся с амфипатической площадкой в субъединице I для дальнейшего исследования.

Проверено действие на ЦО из сердца быка ряда детергентов: холата, дезоксихолата, тритона Х-100, CHOBIMALT, холестерил-гемисукцината. Все проверенные детергенты, за исключением холестерил-гемисукцината, оказывали выраженное ингибирующее действие на дыхание митохондриальной ЦО, окисляющей цитохром с в присутствии аскорбата и ТМФД. Наиболее ярко эффект проявлялся в случае тритона Х-100 и CHOBIMALT с полумаксимальным ингибированием при концентрации детергента около 250 μМ. Из физиологически активных соединений были протестированы стероидный мужской половой гормон тестостерон, ретиноевая кислота и билирубин. Среди них тестостерон и ретиноевая кислота проявляли ингибиторную активность, хотя и слабую (ингибирование не превышало 30%). Билирубин не ингибировал активность ЦО будучи добавлен как в среду инкубации, так и по ходу эксперимента.