ИСТИНА

В предлагаемом проекте мы сконцентрируем наши усилия на изучении фундаментального процесса развития - формировании полярных осей многоклеточного организма. План строения (body plan) многоклеточных организмов может быть определен в терминах симметрии и осей полярности (Беклемишев, 1964; Manuel, 2009). Билатерально симметричные животные имеют две основные оси: дорзовентральную и переднезаднюю. В то же время, низшие Metazoa – Ctenophora, Cnidaria, Porifera имеют единственную ось полярности. Взаимоотношения полярностей билатеральных и небилатеральных животных остаются одной из наиболее фундаментальных неразрешенных проблем современной эволюционной биологии развития. Вовлечены ли в формирование полярных осей высших и низших Metazoa общие молекулярные и клеточные механизмы? Имеют ли эти механизмы единое происхождение от общего предка Metazoa или же они возникли независимо? Ответить на эти вопросы, а также на многие другие, связанные с происхождением и эволюцией многоклеточности и морфогенеза животных, позволят исследования, планируемые в рамках данного проекта. Основной задачей предлагаемого проекта является детальное исследование морфогенезов, вовлеченных в формирование полярных осей в ходе эмбрионального развития, метаморфоза, роста и регенерации губок. Нашим основным модельным объектом будет вид Oscarella lobularis (Homoscleromorpha), занимающей ключевое филогенетическое положение. Исследования будут выполняться на макромофологическом, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. На первом этапе работы партнерами из Франции будет проведен глобальный анализ транскриптов на всех стадиях жизненного цикла O. lobularis. В результате у Oscarella будут идентифицированы ортологи некоторых генов, регулирующих формирование плана строения у высших Metazoa. Вторым этапом молекулярной части работы, проводимой обоими партнерами проекта, будет тестирование выявленных генов на предмет их участия в формировании осей зародыша и взрослого организма Oscarella. В частности, будет проведен анализ экспрессии ряда генов, продукты которых вовлечены в Wnt- ? катенин сигнальный путь (Dsh, GSK-3? и Tcf/Lef), а также генов TGF?, FGF и notch/Delta сигнальных путей в ходе эмбриональных и соматических морфогенезов. Также будет выполнен ряд функциональных экспериментов (см. п. 4.3.). Результаты будут сопоставлены с данными, полученными при изучении морфогенезов, характерных для губок других филогенетических линий, для других представителей низших Metazoa (книдарий) и для высших многоклеточных животных. В ходе реализации данного проекта предполагается получить новые и приоритетные данные о молекулярных, субклеточных и клеточных механизмах морфогенезов у низших Metazoa и их эволюционной значимости.

Основной задачей данного проекта было детальное исследование морфогенезов, вовлеченных в формирование полярных осей в ходе эмбрионального развития, метаморфоза, роста и регенерации губок на примере двух модельных объектов: Oscarella lobularis (Homoscleromorpha) и Halisarca dujardini (Demospongiae), занимающих ключевое филогенетическое положение. Исследования выполнялись на макромофологическом, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. В ходе выполнения проекта проведены эксперименты, связанные с прижизненным изучением морфогенезов при репаративной регенерации эктосомы, почковании и метаморфозе у O. lobularis и H. dujardini. 1. Выявлены клеточные и молекулярные механизмы формирования пор в экзопинакодерме O. lobularis при метаморфозе и регенерации. 2. Реконструированы клеточные основы инвагинации и эвагинации: впервые показано, что формирование пор у O. lobularis осуществляется по типу инвагинации, которая находится под контролем двух Wnt генов. Также показано, что универсальный для эуметазоев механизм инвагинации, включающий формирование колбовидных клеток, также характерен и для губок. 3. Осуществлено ультраструктурное исследование изменения формы клеток в ходе эпителиальных морфогенезов, связанных с изменением площади поверхности эпителия у O. lobularis и у H. dujardini. Впервые показано, что такие эпителиальные морфогенезы, как уплощение, колумнаризация, вытягивание и сокращение клеток в составе пласта, распространение и слияние эпителиев, характерны и для Homoscleromorpha. 4. В сотрудничестве с американскими и французскими партнерами, первые показана гомология сДНК базальной мембраны и adhaerens junctions O. lobularis с билатеральными животными. 5. Проведено постадийное ультраструктурное описание регенерации экзопинакодермы у обоих видов в контроле и при воздействии веществ, нарушающих нормальную работу регуляторных биохимических путей (LiCl, BIO-acetoxime, azakenpaullone и alsterpaullone). 6. Проведены эксперименты по влиянию фармакологических агентов на различные участки сигнального пути Wnt при регенерации модельных видов: IWR-1 (inhibitor wnt response 1); PNU-74654, связывающий бета-катенин и не допускающий рекрутирование им транс-активатора TCF/Lef. 7. Нами впервые показано, что при регенерации O. lobularis эктопическая активация Wnt вызывает усиленное формирование остий на регенерирующей поверхности, а ингибирование данного сигнального пути стимулирует образование выростов экзопинакодермы раневой поверхности. 8. Впервые на губках, нами отработан метод оценки пролиферативной активности клеток с использованием включения меченых предшественников, включающихся клетками в состав ДНК в ходе S фазы – этинилдезоксиуридин (EdU), описана динамика и локализация пролиферации в ходе регенерации H. dujardini и O. lobularis. Показано, что для интактных и регенерирующих O. lobularis характерен сходный паттерн распределения синтетически активных ядер. Таким образом, регенерация у Oscarella происходит не за счет массовой пролиферации близлежащих клеток, как у демоспонгий (Halisarca), а за счет их трансдифференцировки. Также впервые показано, что у H. dujardini, у которой отсутствует эпителиальная организация, Wnt путь регулирует трансдифференцировку хоаноцитов, а не миграцию клеток в ходе регенерации. 9. Начата работа по секвенированию транскриптома Halisarca dujardini. Показано, что он содержит более 50 тыс полноразмерных транскриптов, среди которых обнаружено 29 Wnt-подобных последовательностей. 10. Полученные результаты доложены на 9-ти международных конгрессах, двух отечественных конференциях и на приглашенном семинаре (Роскоф, Франция). Опубликована одна монография, 11 статей и 11 тезисов докладов. Результаты проекта войдут в магистерскую диссертацию (2013 г). Проведено два рабочий семинара французской и российской групп в С-Петербурге и в Марселе. Результаты, полученные в ходе выполнения данного проекта, носят приоритетный характер, с уровнем, соответствующим мировому. Проведенный нами детальный сравнительный анализ клеточных основ морфогенезов Porifera будет способствовать решению ряда эволюционных проблем, связанных с происхождением и эволюцией эпителиев и эпителиальных морфогенезов у животных в ходе их развития и при формировании плана организации тела.