| Результаты этапа: Создана оригинальная компьютерная программа для анализа микроскопических изображений эмбриональных тканей. Для каждой клетки программа позволяет рассчитать положение «центра масс», площадь, периметр, отношение периметра к площади, длины наибольшей и наименьшей осей, их отношение, характеристики вписанного и описанного эллипсов, угол между длинной осью клетки и выбранным направлением и число соседей.
Определено характерное время, необходимое эмбриональной ткани для «запоминания» искусственно навязанных ей механических напряжений. Установлено, что 20 мин являются достаточным временем для «усвоения» тканью навязанной ей морфологии, причем на данном сроке навязанная конфигурация еще не является равновесной.
Исследованы механические параметры эмбриональных тканей X.laevis на ст. гаструлы методом плавной деформации. Получены значения модуля упругости для крыши бластоцеля 25,7±3,7 кПа, сходные с характеристиками для мягких биологических тканей.
Исследовано влияния механических напряжений на экспрессию и локализацию белка плотных контактов клаудина 4. Исследован паттерн его экспрессии. Показано, что XCldn4 преимущественно экспрессируется в поверхностном эпителии, его уровень повышен в растянутых областях наибольшей кривизны , и снижен в зонах сдавления, где формируются колбовидные клетки. Экспрессия XCldn4 находится под контролем RhoA и зависит работы комплекса актин-миозин. Предложена схема регуляции экспрессии XCldn4 механическим напряжением. Белок XCldn4 распределен равномерно по периметру апикальных частей клеток. Механическое растяжение клеток приводит к полярному перераспределению клаудина 4 в них.
Показано, что релаксация механических напряжений в тканях зародышей Xenopus на стадиях бластулы-ранней гаструлы приводит к возрастанию изменчивости паттернов экспрессии генов Chordin и Xnr3, а релаксация путем инкубации в гипертоническом растворе вызывает расширение паттерна и усилении экспрессии этих генов .
Обнаружена экспрессия 20 механозависимых каналов для Са, N, K и Cl ( Piezo1, Piezo 2, PKD1, PKD2, TRPV1, TRPV4, TRPM4 , TRPM7 , TRPC1, TRPA1, CFTR, сплайсинговая форма К-канала SAKca и др) в раннем развитии Xenopus. Методом ПЦР в реальном времени количество мРНК генов TRPV4, TRPM7, TRPC4 , SACca, PKD2, CFTR и Piezo1, снижается от зиготы к нейруле , а затем нарастает к личиночным стадиям. Установлена региональность экспрессии для ряда генов в различных слоях зародышей и вдоль анимально-вегетативной оси. Методом гибридизации in situ исследован пространственно-временной паттерн экспрессии генов Ca-каналов Piezo 1 и 2.
Показано, что блокирование работы каналов ионами гадолиния нарушает интеркаляцию клеток в развитии Xenopus и морского ежа Paracentrotus lividus. Установлено, что инкубация с гадолинием вызывает снижение экспрессии гена Hedgehog в 5 раз у морского ежа.
Исследовали роль механозависимых каналов и щелевых контактов в механизме пульсационного роста гидроидных полипов. Установлено, что под действием блокаторов щелевых контактов (октанола и карбеноксолона) эпидермальные клетки останавливаются в фазе спада, тогда как гадолиний они останавливает клетки в набухшем состоянии. Предложена рабочая гипотеза регуляции пульсационных движений.
Продолжено исследование роли механического напряжения в определении полярности и топологии эмбрионального ресничного эпителия шпорцевой лягушки. Показано , что эксплантация приводит к хаотизациии паттерна, а механическое растяжение тканей может упорядочивать и ориентировать планарную полярность. Результаты показывают, что топология и планарная полярность ресничного эпителия – независимые признаки. В определении планарной полярности существенную роль играют механические факторы.
Методом атомно-силовой микроскопии впервые проведено сканирование поверхности живого развивающегося зародыша шпорцевой лягушки на стадиях бластулы-нейрулы. Выявлены перестройки контактных поверхностей клеток, протекающие в течение нескольких минут. Получены оценочные данные по модулям упругости поверхности зародыша в масштабах нескольких микрон в норме и при активации RhoA. |
