| Результаты этапа: 1. Изучена локализация активной формы RhoA (актRhoA) в цитоплазме клеток эмбрионов шпорцевой лягушки на стадии гаструлы. Показано, что актRhoA сконцентрована в апикальном кортикальном слое поверхностных клеток зародыша, а также на латеральных мембранах в зоне кольца апикальных контактов. Уровень актRhoA повышен в цитоплазме в углах клеток и в интердигитирующих ламеллах. Уровень актRhoA в клетках дорсальной маргинальной зоны выше, чем в вентральной зоне. Показано, что фактор обмена гуаниновыми нуклеотидами Larg способен специфически активировать RhoA, переводя её в ГТФ-связанное состояние, причем активация RhoA с участием Larg осуществляется у мембраны, возможно в мультимолекулярных комплексах контактов.
2. Исследовали активацию RhoA при экспериментальной модуляции механических напряжений. Предварительные опыты показали, что при искусственном изгибе образца ткани уровень RhoA-RBD-GFP в клетках сжатой поверхности выше, чем в клетках растянутой стороны.
3. Исследовали роль механических напряжений в откладке фибронектинового (ФН) матрикса на внутренней поверхности крыши бластоцеля и в миграции мезодермальных клеток по внеклеточному матриксу.
Показано, что в образцах крыши бластоцеля, искусственно растянутых в продольном или поперечном направлении, в течение первого часа после механических воздействий ФН фибриллы удлиняются и ориентируются в направлении растяжения. В релаксированных образцах уже отложенный ФН за этот срок деградирует, а затем вновь восстанавливается. В крыше бластоцеля интактных зародышей выявлена зона, полностью свободная от ФН, локализованная в непосредственной близости от бластопора.
Методом цейтрафферной микрокиносъемки было показано, что мезодермальные клетки движутся преимущественно по направлению растяжения субстрата, в то время как на нерастянутых субстратах мезодермальные клетки движутся хаотично или по спиральным траекториям.
4. Исследовали клеточные и молекулярные механизмы нового явления – активного усиления кривизны искусственно деформированного участка крыши бластоцеля и супрабластопоральной области зародышей шпорцевой лягушки.
Показано, что в течение первых двух часов после искусственного изгиба апикальные индексы (AI) клеток вогнутой стороны постепенно возрастают. Эта постепенность указывает на активную реакцию клеток на механическое воздействие. После 4 ч культивирования AI клеток вогнутой стороны уменьшается, а на растянутой стороне практически не изменяется. Снижение AI клеток вогнутой стороны может быть связано с иммиграцией эпителиальных клеток из пласта - эпителиально-мезенхимальным переходом (ЭМП). Обработка образцов витальной липофильной краской FM 4-64FX показала, что на вогнутой стороне эксплантата идет активный эндоцитоз. Было также показано, что на вогнутой стороне у эпителиальных клеток количество белка XLgl1 существенно снижалось по сравнению с растянутой стороной и контролем, что свидетельствует о нарушении полярности клеток сжатой стороны.
Добавление 10 ?M цитохалазина В не только не было предотвращало, но наоборот усиливало формирование колбовидных клеток. В то же время при воздействии 100 ?M блеббистатина (ингибитор АТФазы миозина IIА) удлинение клеток было полностью блокировано. Полученные результаты говорят о том, что для апикального сокращения и удлинения клеток беспрепятственная работа миозина II является важнее, нежели правильная структурная организация актинового цитоскелета.
|
