ИСТИНА

Дрожжевая модель для изучения патофизиологических эффектов хантингтина была предложена в 2002 году: было показано, что экспрессия N-концевой части удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина человека (103Q) в дрожжах S. cerevisiae приводит к замедлению роста, нарушению клеточного цикла и эндоцитоза, образованию агрегатов в цитоплазме и ядре. Полиглутамин зависимая смерть клеток S.cerevisiae проявляет много сходства с полиглутамин зависимой смертью нейронов (Meriin et al., 2002, PMID: 12058016). Ранее нашей группой было показано, что экспрессия 103Q в дрожжах вызывает клеточную смерть с типичными для животных маркерами программируемой клеточной смерти (Sokolov et al., 2006). В следующих работах (Bocharova, et al, 2008, Bocharova et al 2009) нами было показано, что токсичность продукции 103Q в дрожжах может быть связана с перегрузкой убиквитин-протеосомной системы деградации белков. Отправной точкой предлагаемого проекта является наше неопубликованное наблюдение о том, что при переносе клеток, продуцирующих 103Q, со среды с индуктором продукции (галактозы) на среду с отсутствием продукции (глюкозу) сопровождается смертью значительного процента 103Q-клеток, а также образование респираторно некомпитентных клеток (petite). У клеток, продуцирующих контрольную конструкцию - N-концевой фрагмент хантингтина человека дикого типа (25Q), перенос с галактозы на глюкозу не вызывал нарушений. Перенос клеток с галактозы на глюкозу в норме приводит к частичному переключению метаболизма с дыхания на гликолиз (эффект Крэбтри). Мы показали, что перенос 103Q-клеток на глюкозу сопровождается не падением (как у дикого типа и 25Q-контроля), а ростом потенциала на митохондриальной мембране. Наша рабочая гипотеза такова: на внутренней мембране митохондрий находится белок, способный в присутствии высокой концентрации 1,6-фруктозо дифосфата (или другого маркера активного гликолиза) тормозить дыхательную цепь или снижать уровень сопряжения митохондрий. Данный белок – субстрат (прямой или опосредованный) убиквитин-протеосомной системы. Данное предположение было подтверждено экспериментами с штаммом температур-чувствительным мутантом одной из основных убиквитин-лигаз - cdc53-1.

На первом этапе проекта мы исследовали как клетки координируют гликолитический и дыхательный способы синтеза АТФ. Литературные, а также наши предварительные данные указывают, что дрожжи S.cerevisiae обладают механизмом ингибирования дыхания митохондрий при работающем гликолизе (эффект Крэбтри). Такое ингибирование необходимо для предотвращения гипер-интенсивного синтеза АТФ, и, как следствие, гипер-поляризации митохондрий и генерации активных форм кислорода. В ходе выполнения проекта для проверки данной гипотезы нами были подобраны условия, в которых клетки дикого типа тщетно пытаются расти за счет гликолиза, а мутантные по системе Крэбтри растут за счет митохондриального дыхания. Нами также было показано, что величина мембранного потенциала S. cerevisiae после переноса с бедного на богатый источник углерода зависит от фазы клеточного цикла и максимальна в G1-фазе и минимальна в S-фазе. Последнее свидетельствует об особенностях регуляции эффекта Крэбтри в G1-фазе. На следующем этапе исследования влияния внутриклеточных белковых агрегатов на митохондрии дрожжей Saccharomyces cerevisiae мы получили следующие ключевые результаты. Было показано, что митохондриально кодируемый белок Var1p, компонент митохондриальной рибосомы, гидрофильный, положительно заряженный и склонный к агрегации способен физически взаимодействовать с митохондриальной ДНК. Наши данные показывают, что Var1p при стрессе регулирует стабильность митохондриальной ДНК. Мы показали, что ингибитор митохондриальной трансляции эритромицин предотвращает потерю митохондриальной ДНК в контрольных клетках, но не клетках продуцирующих митохондриально-кодируемый белок Var1p в ядре. Мы предложили механизм действия Var1p на стабильность митохондриальной ДНК: агрегаты Var1p сформированные после стресса связывают митохондриальное ДНК и портят ее и/или влияют на репликацию (Litvinchuk et al 2013). Так же было показано, что Фосфофруктокиназа-2 бифункциональный фермент гликолиза является перспективной мишенью антираковой терапии. А именно был открыт новый класс аминофуразан-триазолов, которые способны в микромолярных концентрациях специфическим ингибированием фосфофруктокиназы-2 предотвращать пролиферацию нескольких видов опухолей, активно использующих гликолиз для роста (Pyrkov et al 2013).