Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтезаНИР

Mechanisms of energy transformation by bioferments of photosynthesis

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза
Результаты этапа: 4.1. Основная функция пигмент-белкового комплекса фотосистемы 2 (ФС 2) – использовать энергию солнечного света для разделения зарядов, за которым следуют две существенные химические реакции: окисление воды и восстановление пластохинона. Эти реакции разделены в пространстве и происходят на центральной – фотохимической, акцепторной – пластохинонвосстанавливающий и донорной – водоокисляющий участках реакционного центра (РЦ) в тилакоидной мембране.Однако поиск новых веществ, способных более эффективно стабилизировать структуру и функциональное состояние комплексов ФС 2, несомненно, является важной и перспективной задачей. В отчетной период времени нами было изучено влияние уникального по своим физико-химическим характеристикам дисахарида трегалозы на изолированные комплексы ФС2. Показано, что трегалоза значительно стимулирует стационарную скорость выделения кислорода. Трегалоза также предотвращает инактивацию при длительном хранении образцов ФС2. Предположено, что в присутствии трегалозы в результате изменения гидратации комплекс ФС2 переходит в конформацию, более оптимальную для эффективного функционирования. Также было исследовано первичные процессы переноса электрона и энергии в пигмент-белковых комплексах фотосистемы 1 (ФС 1) из цианобактерий с помощью методом «памп-проб» в ответ на единичные вспышки лазера (25 фс) при 670, 700, и 720 нм. Было показано, что соотношение между числом возбужденного хлорофиллаа в антенне и фотосинтетическимреакционным центром зависит от спектральных характеристик действующего импульса. На комплексах РЦ ФС 1 продемонстрирован рекордно быстрый перенос электрона между первичным донором электронов Р700 и первичным акцептором А0 (<150 фс). В результате проделанной работы выявлены основные факторы, определяющие рекордную в живой природе скорость переноса электронов в ФC 1 и квантовый выход близкий к 100%. Эти факторы необходимо учитывать при конструировании относительно простых и стабильных искусственных фотосинтетических систем преобразования и аккумуляции солнечной энергии на основе принципов природного фотосинтеза.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза
Результаты этапа:
4 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза
Результаты этапа: На препаратах ФС 1, высушенных на стеклянной подложке в присутствии трегалозы и уравновешенных при влажности 53% и 11% была исследована кинетика рекомбинации зарядов на длине волны 810 нм, обусловленная восстановлением фотоокисленного Р700+. Было показано, что при высокой влажности (54%) основные компоненты кинетики спада дельта А(810 нм) хорошо аппроксимируются двумя экспоненциальными составляющими с характерными временами ~20 и ~190 мс в соотношении 1:6. Эти компоненты обусловлены рекомбинацией зарядов между терминальными железо-серными центрами FA/FB- и Р700+. При понижении влажности до 11% наблюдалось существенное ускорение кинетики рекомбинации зарядов и могло быть описано экспоненциальными компонентами со временами жизни 8 и 120 мс в соотношении 2:1. При этом кинетика недостаточно удовлетворительно аппроксимировалась экспоненциальными составляющими и лучше описывалась степенным разложением со средними временами жизни 10 и 200 мс (соотношение 2:1), соответствующему «размазанному» распределению комплексов по скоростям рекомбинации. Известно, что при низкой температуре в комплексах ФС 1 блокируется перенос электронов на терминальные акцепторы FA/FB и существенно замедляется рекомбинация зарядов между FX и Р700+. При этом проявляется гетерогенность кинетики рекомбинации, связанная с эффектом «замораживания» различных конформационных состояний белка. Сходный эффект наблюдается и в присутствии трегалозы при низкой влажности. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что эффект высушивания ФС 1 в присутствии трегалозы является в какой-то степени аналогом эффекта понижения температуры, ограничивая подвижность белка и препятствуя переносу электрона как в ходе прямых, так и в ходе обратных реакций. В связи с этим выводом нами была предпринята попытка определить, влияет ли высушивание ФС 1 в присутствии трегалозы на кинетику первичных реакций переноса электрона в ФС 1. С этой целью комплексы ФС 1, высушенные на стеклянной пластинке в присутствии трегалозы (влажность 11%) были исследованы с помощью импульсной фемтосекундной спектрометрии с разрешением 20 фс. Было показано, что кинетика переноса электрона от восстановленного первичного акцептора электрона А0- на вторичный акцептор А1 имеет характерное время ~ 28 пс. Это характерное время практически не отличается от определенного нами ранее характерного времени этой реакции в комплексах ФС 1 в растворе. Можно заключить, что ограничение подвижности белка, обусловленное эффектом трегалозы, покрывающей снаружи белковую глобулу, не влияет на образование первичной Р700+А0- и вторичной Р700+А1- ион-радикальных пар в ФС 1.
5 1 июля 2017 г.-31 декабря 2017 г. Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза
Результаты этапа: На предыдущем этапе НИР исследовалось поведение комплексов фотосистемы 1 (ФС1) в условиях ограниченной подвижности этого пигмент-белкового комплекса, вызванной высушиванием в стекловидной матрице дисахарида трегалозы. Было показано, что эффект трегалозы на перенос электрона сходен с эффектом охлаждения системы до температуры стеклования белка. Однако литературные данные о кинетике рекомбинации зарядов в ФС1 при низкой температуре крайне ограничены и были измерены только при нескольких выбранных температурах. Нами была изучена кинетика восстановления фотоокисленного первичного донора Р700 в комплексах ФС1, лишенных железо-серных кластеров Fx, Fa и Fb, выделенных из мутанта rubA цианобактерии Synechococcus sp. PCC 7002, в широком диапазоне температур от 20 до 290 К с шагом 10 К. В подобных комплексах прямой перенос электрона ограничивается вторичными акцепторами хинонами А1, что существенно упрощает анализ экспериментальных данных. Кинетика рекомбинации зарядов между восстановленным акцептором А1 и окисленным первичным донором электрона Р700 была измерена с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии путем регистрации индуцированных лазерными вспышками изменений поглощения на длине волны 820 нм. Кинетики были проанализированы с помощью программы CONTIN, позволившей выделить в них две основные компоненты, приписанные рекомбинации с хинонных акцепторов А1А и А1В в симметричных ветвях редокс-кофакторов A и B. Характерные средневзвешенные времена гетерогенных компонент рекомбинации были независимы от температуры ниже 150 K (25 и 400 мкс для ветвей В и А, соответственно) и ускорялись до 10 и 80 мкс при комнатной температуре. Энергии активации этих реакций в области 150-290 К составляли 19 и 13 кДж моль-1, соответственно. При охлаждении комплексов ниже температуры стеклования белка (170 К) соотношение между прямыми реакциями в двух ветвях существенно изменялось в пользу ветви А, что не может быть объяснено в рамках представлений об активационных реакциях переноса электрона. Электрон-фононное сопряжение переноса электронов в ФС1 было проанализировано в рамках квантовой неадиабатической многофононной теории. Электронное сопряжение и факторы Франка-Кондона для прямых и обратных реакций между P700 и A1A/A1B были оценены согласно классическим эмпирическим моделям (эмпирическое приближение Мозера-Даттона, модель PATHWAYS Бератана и соавт.) и квантовой неадиабатической многофононной теории. Квантовая модель аппроксимирует поляризацию белка двумя упругими фононными модами. Высокочастотный режим сильно сопряжен с переносом электрона (частота ~1000 см-1, энергия реорганизации ~0,7 эВ) и принимает на себя основную часть изменения энергии. Низкочастотная мода слабо сопряжена с переносом электрона (частота 160-240 см-1, энергия реорганизации 10-30 мэВ), обеспечивает точную регулировку уровней энергии в системе и объясняет слабые температурные зависимости реакций переноса электрона. Предложенная модель позволяет обосновать асимметрию первичного разделения заряда, проявляющуюся в существенном преобладании рекомбинации с хинона А1А при низких температурах. Было показано, что механизм переноса электрона при комнатной температуре существенно зависит от ядерного туннелирования. Диэлектрическое поведение комплексов ФС1 напоминает свойства кристаллических и стекловидных твердых тел и требует квантового рассмотрения во всем диапазоне температур.
6 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза
Результаты этапа: Светозависимое выделение кислорода при фотосинтезе – основополагающий природный процесс, однако молекулярный механизм разложения воды комплексами фотосистемы 2 (ФС 2) изучен недостаточно детально. Кроме того, комплекс окисления воды (КОВ) ФС 2 является наиболее лабильным участком во всей электрон-транспортной цепи фотосинтезирующих оксигенных организмов. Поэтому изучение влияния осмолитов на КОВ ФС 2 является важной и актуальной проблемой. С помощью импульсной спектрометрии на ядерных комплексах ФС 2 показано, что трегалоза оказывает стабилизирующее действие на КОВ. Поляриметрические и флуориметрические методы продемонстрировали, что трегалоза вдвое стимулирует стационарную скорость выделения кислорода, а также увеличивает относительную долю реакционных центров ФС 2, способных окислять QA–. С помощью прямого электрометрического метода показано, что трегалоза не влияет на кинетику электрогенного переноса электрона от Mn на редокс-активный радикал тирозина Yz• (переход S1→S2), но заметно ускоряет кинетику выброса протонов вблизи марганцевого кластера при S2 → S3 и S4 → S0 переходах КОВ. Была исследована кинетика редокс-переходов первичного донора электрона ФС 2 – димера хлорофилла Р680 в высушенных стекловидных трегалозных матрицах путем регистрации изменений поглощения на длине волны 830 нм. Показано, что, по сравнению с раствором, наблюдается частичное блокирование прямой реакции переноса электрона между тирозином Yz и P680+ (~10 мкс), и появление медленной компоненты с характерными временами 100-150 мкс, вероятно обусловленной обратным переносом электрона от восстановленного первичного хинонного акцептора QA- на P680+. С помощью полярографии и флуорометрии было исследовано влияние влияние другого осмолита - гетероциклической аминокислоты гидроксиэктоина (Ect-OH) - на препараты ФС 2 с активным КОВ и продемонстрировано, что стационарная скорость выделения кислорода в присутствии этого осмолита увеличивается приблизительно на 40%. Показано также, что Ect-OH ускоряет перенос электронов от экзогенных доноров к РЦ в препаратах ядерных комплексов ФС 2, лишенных марганцевого кластера. Предполагается, что Ect-OH может служить для этих препаратов искусственным донором электрона, который не взаимодействует напрямую ни с донорной, ни с акцепторной стороной РЦ. Методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) изучено влияние дисахаридов трегалозы и сахарозы на активность хлоропластов шпината при псевдоциклическом транспорте электронов (Н2О → ФС 2 → ФС 1 → О2). О фотохимической активности хлоропластов судили по кинетике редокс-превращений Р700 - первичного донора электрона в ФС 1. Генерацию транстилакоидной разности рН (∆pH) регистрировали с помощью парамагнитного зонда ТЕМПамин. Показано, что при хранении изолированных хлоропластов (4°С) они сначала теряют способность поддерживать к светозависимой генерации ∆pH, а затем у них падает фотохимическая активность ФС 2. Падение фотохимической активности хлоропластов и их способности генерировать ∆pH замедляются в присутствии 0,5 - 1,0 М трегалозы и, в меньшей степени, в присутствии сахарозы. Методом спиновых меток начато исследование влияния осмолитов на липидный матрикс, окружающий ФС 1 и ФС 2. В качестве индикаторов структурного состояния использовали водорастворимые и липидорастворимые спиновые зонды. Показано, что ФС 1 является более эффективным восстановителем водорастворимых радикалов, чем ФС 2. В то же время липидорастворимые зонды слабо восстанавливаются этими белками. Этот результат составляет методическую базу для решения важной задачи проекта – выяснения влияния осмолитов на структурное состояние липидного окружения ФС 1 и ФС 2.
7 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза
Результаты этапа: С помощью импульсной абсорбционной спектрометрии с субмикросекундным временным разрешением исследована кинетика рекомбинации зарядов в диапазоне температур (Т) от 4 К до 310 К в комплексах ФС 1, выделенных из цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Анализ кинетики рекомбинации зарядов в нативных комплексах ФС 1 (далее – комплексы Р700-FA/FB) в широком температурном диапазоне позволил выделить компоненты рекомбинации, соответствующие отдельным обратным реакциям переноса электрона от различных редокс-кофакторов на Р700+. Были определены кинетика и термодинамика различных реакций рекомбинации зарядов. Показано, что при Т>180 К в кинетике восстановления фотоокисленного Р700+ преобладает компонента рекомбинации с терминальных 4Fe-4S кластеров FA/FB, в то время как при Т<170 К большая часть электронов не достигает даже кластера FX и рекомбинирует преимущественно с филлохинонного акцептора А1. Кинетика реакций переноса электрона является безактивационной при T<170 К, что соответствует переходу исследуемой системы в стекловидное состояние. Было обнаружено, что при T>170 К рекомбинация зарядов от терминальных 4Fe-4S-кластеров FA/FB может происходить по двум различным путям, характеризующимся различными значениями энергии активации (Ea). Рекомбинация с кластеров FA/FB через кластер FX и филлохинонный акцептор А1А характеризуется Ea~290 мэВ и является преобладающей при Т>280 К, в то время, как рекомбинация с прямой реакцией между 4Fe-4S кластером FX- и Р700+ характеризуется Ea~20 мэВ и становится доминирующей в диапазоне температур от 200 до 270 К. Рекомбинация зарядов от кластера FX становится чрезвычайно гетерогенной при Т< 200 К. Кроме того, была исследована температурная зависимость кинетики рекомбинации зарядов в комплексах ФС 1, лишенных субъединицы PsaC и терминальных железо-серных кластеров FA/FB (называемых Р700-Fx-core комплексами). В целом температурные зависимости кинетик рекомбинации на Р700-FA/FB и Р700-Fx-core комплексах были сходны. При уменьшении температуры от 300 до 200 К наблюдалось замедление основной кинетической компоненты, соответствующей рекомбинации с FX, от 3 мс до ~10 мс с энергией активации порядка 100 мэВ. При понижении температуры от 200 до 150 К происходило резкое падение амплитуды и замедление кинетики этой компоненты до секундных времен. При дальнейшем понижении температуры кинетика компоненты рекомбинации от FX на Р700+ не менялась. При понижении температуры эта компонента становилась гетерогенной со средневзвешенным временем, меняющимся от 4 мс при Т=310 К до ~100 мс при Т<150 К. Гетерогенность кинетики резко увеличивалась при Т<250 К, что отражало иммобилизацию белка в различных конформационных состояниях, характеризующихся сильно различающимися характерными временами. Конформационная подвижность ФС 1 была изучена с помощью молекулярной динамики. Было обнаружено, что кластер FX может принимать одно из двух конформационных состояний, поворачиваясь на 30 градусов вокруг оси между атомами серы. Изменение ориентации FX относительно электрического поля, создаваемого окружающими атомами белка, приводит к изменениям электрического потенциала на атомах кластера, что может служить причиной изменений преимущественной локализации электронной плотности на атомах FX и его редокс-потенциала. Эти эффекты могут объяснять частичное прекращение прямого переноса электрона от филлохинонного акцептора А1 на FX и далее на FA/FB, а также возникновение существенной гетерогенности кинетики рекомбинации, наблюдаемое при температуре перехода системы белок/глицерин/вода в стекловидное состояние (170 – 200 К).
8 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза
Результаты этапа:
9 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза
Результаты этапа:
10 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Исследование механизма превращения энергии ферментами фотосинтеза
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".