Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомамиНИР

The study of the structure of RNA and their complexes with the ribosomes

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа: 1. Исследована роль глицил-тРНК синтетазы (GlyRS) в инициации трансляции на РНК полиовируса. 2. Установлен механизм инициации белка при стрессовых условиях, ведущих к инактивации фактора eIF2. 3. Выдвинута гипотеза о существовании альтернативного механизма инициации трансляции, который не является ни кеп- зависимым, ни IRES-опосредованным.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа: С помощью рибосомного профайлинга идентифицированы мРНК, трансляция которых стимулируется наличием в клетках фактора DAP5. Одновременно Д.Е. Андреевым усовершенствован сам метод рибосомного профайлинга.
4 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа: Проведены эксперименты по установлению механизма функционирования белка DAP5 (Death Associated Protein 5), фактора инициации трансляции у животных, который, по-видимому, направляет кеп-независимый способ инициации трансляции. Считается, что кеп-независимый способ инициации трансляции используется в клетках животных при апоптозе, различных стрессовых воздействиях, включая химиотерапию, а в норме при дифференцировке клеток. Как работает DAP5 до сих пор не известно. В настоящее время наиболее популярная идея заключается в том, что этот белковый фактор обслуживает клеточные IRES-элементы. (IRES-элементы это такие структуры в 5' нетранслируемых областях (НТО) мРНК, которые позволяют протекать кеп-независимым механизмам инициации трансляции.) Наши данные, полученные в ходе выполнения этого проекта, не согласуются с этой теорией: белковый фактор DAP5 стимулирует трансляцию любых модельных мРНК, если их 5' НТО не содержат кепа на 5' конце, хотя разные РНК стимулируются в разной степени. Общий вывод состоит в том, что классический кеп-зависимый способ инициации и DAP5-опосредуемый являются скорее всего конкурентными, а не взаимодополняющими механизмами, то есть последний работает тогда, когда отключен стандартный механизм. Методом CRISPR-CAS9 получен нокаут по DAP5 в клеточной линии фибробластов мышей NIH3T3. Отсутствие в клетках NIH3T3 белка DAP5 не влияло драматическим образом на их рост и деление. Это согласуется с общим мнением, что DAP5-опосредованный механизм работает только при определенных условиях и не обязателен для пролиферативного роста клеток. Тем не менее, нами получены данные о том, что отдельные мРНК в большей степени зависят от DAP5, чем большинство других. Их трансляция стимулируется даже в том случае, когда они содержат кеп, то есть находятся в естественном состоянии. Сделано предположение, что существуют некие элементы в структуре мРНК, которые повышают способность мРНК использовать DAP5- зависимый механизм инициации трансляции. Природа этих элементов в настоящее время изучается.
5 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа: С помощью современной методики, Рибосомного Профайлинга, проведен анализ мышиных клеток NIH3T3, в которых нокаутирован (инактивирован) ген, кодирующий инициирующий фактор DAP5 (eIF4G2). Собрана коллекция данных по трансляции мРНК, которые используют при инициации трансляции фактор DAP5 (eIF4G2). Фактически во всех случаях, влияние нокаута на трансляцию этих отдельных мРНК не является драматическим, трансляция в среднем снижается не более, чем в два раза. Это показывает, что при нормальных условиях роста, все мРНК могут использовать классический механизм инициации трансляции, основанный на использовании фактора eIF4G1. Только в особых условиях (стресс, дифференцировка), когда eIF4G1 не работает, отдельные мРНК начинают использовать eIF4G2.
6 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа: К настоящему моменту полностью определен круг тех мРНК, которые для своей эффективной работы требуют фактор инициации трансляции DAP5 (eIF4G2). Это в основном те мРНК, которые кодируют белки, осуществляющиу в клетке регуляторные функции, например вступление в фазу клеточного деления. Они также кодируют специализированные белковые факторы, которые определяют дифференцировку клеток. В частности, данные исследования важны с точки зрения нашего понимания, как клетки могут приобретать такие вредные для организма свойства как некотролируемое клеточное деление. В основном создана бесклеточная система, в которой будут собираться инициаторные рибосомные комплексы с участием фактора DAP5. Это позволит идентифицировать белковые партнеры этого фактора, без которых он не может работать. Мы надеемся в основном завершить этот цикл исследований уже в 2019 году.
7 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа: 1. Идентифицирована целая серия мРНК, уровень трансляции которых зависит от наличия eIF4G2 (DAP5) в клетках млекопитающих HEK 293.Эти мРНК обладают достаточно длинными (>300 нуклеотидных остатков) 5’ нетранслируемыми последовательностями (НТО), хотя очевидно, что длина 5’ НТО является не единственной и вероятно не главной особенностью DAP5-зависимых мРНК. Все такие мРНК оказываются зависимыми и от канонического фактора eIF4G1.мРНК, зависимых от eIF4G2, но независимых от канонического eIG4G1 пока не обнаружено. 2. Создана высоко чувствительная композитная бесклеточная система трансляции на основе клеточного экстракта из клеток HEK 293. Система необходима для того, чтобы воспроизвести феномен зависимости от DAP5 in vitro и, если это получится, использовать ее для выяснения как работает фактор DAP5 (eIF4G2) и какие у него взаимоотношения с партнерами, сходства и отличия от канонического фактора eIF4G1. 3. Показано, что трансляция мРНК, кодирующей известный мРНК-свывающий белок PCBP2 зависит от наличия активного DAP5 белка. В свою очередь при повышении в клетке концентрации PCBP2, трансляция мРНК DAP5 ингибируется,создавая тем самым регуляторную петлю. 4. Хотя по литературным данным DAP5 образует комплекс с инициирующим фактором eIF2 и это якобы нужно для функции DAP5, нам не удалось подтвердить это предположение. Оказалось, что трансляционные мРНК-мишени ни в нормальных условиях, ни при нокдауне DAP5, не обладают какой-то особой чувствительностью к фосфорилированию, то есть к инактивации eIF2, а мРНК, чья трансляция устойчива к фосфорилированиюe IF2 (ATF4, ATF5, IFRD1, UCP2), не становятся чувствительными к фосфорилированиюe IF2 при нокдауне DAP5. 5. Проведены эксперименты, имевшие целью попытаться превратить с помощью мутаций DAP5-зависимые 5’НТО в DAP5-независимые и наоборот. Пока полученные результаты противоречивы и не позволяют сделать надежных выводов и эти попытки будут продолжены в следующем году. 6. Проведены эксперименты, направленные на проверку существующего предположения от группы Р. Шнайдера (New York University), что субъединица d из важнейшего мультисубъединичного фактора инициации эукариот eIF3 взаимодействует с фактором DAP5. Ни в одном из проверочных опытов нам не удалось получить какого-либо подтверждения этой гипотезы.
8 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа: 2020 год оказался очень успешным для работы по тематике этого проекта и по выполнению плана работ на 2020 год, несмотря на крайне неблагоприятные условия научной деятельности и вынужденные длительные простои из-за пандемии covid-19. Наконец-то лаборатория совершила настоящий прорыв по тематике, связанной с загадочной функцией белка DAP5(другое название eIF4G2)и, как всегда, догадка, как работает этот фактор инициации синтеза белка, пришла совершенно неожиданно. Проверка этой догадки потребовала всего несколько месяцев упорной экспериментальной работы. Оказалось, что eIF4G2 является важнейшим компонентом вспомогательной сканирующей системы у высших эукариот. Такой системы нет в простейших эукариотах и,как следствие, там (например у дрожжей) гена белка DAP5 просто нет. Оказалось, что DAP5 требуется для мРНК с очень длинными 5'-нетранслируемыми последовательностями (5'НТО). В частности фактор eIF4G2 часто необходим, если 5'НТО содержат так называемая upstream reading frames (uORFs). Когда сканирующие 40S рибосомные комплексы подходят к такой рамке (uORF), то часть из них превращается в 80s рибосомы и начинает ее транслировать, а часть остается в виде сканирующих комплексов. Такая ситуация приводит к интерференции между сканирующими 40S комплексами и 80S элогирующими рибосомами, синтезирующими пептид при прохождении uORF. Эта интерференция приводит к диссоциации из сканирующих 40S комплексов их важнейшего компонента, фактора инициации eIF4G1. Этот фактор тут же замещается функционально близким белком eIF4G2, тем самым спасая сканирующие 40S комплексы, давая им возможность достичь основной рамки считывания и инициировать синтез главного белка данного гена. Это очень важный механизм, поскольку мРНК с длинными 5'НТО и дополнительными uORFs как правило кодируют разнообразные регуляторные белки, вовлеченные в дифференцировку клеток, развитие, ангиогенез, апоптоз и т.д. Можно без ложной скромности заключить, что Лаборатория сделала крупное открытие в механизмах синтеза белков у высших эукариот, включая человека. Работа уже подготовлена к публикации в высокорейтинговом журнале. Кроме того, опубликованы две работы с важными и интересными данными в журналах PNAS и IJMS. Первая их этих статей описывает крайне любопытный факт. Оказалось, что важный ген POLG, кодирующий каталитическую субъединицу ДНК-полимеразы митохондрий, на самом деле является белком с двойным кодированием. Он, в другой рамке считывания, но почти полностью перекрывающийся с рамкой считывания POLG, кодирует еще один секретируемый белок размером ~30кД.
9 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа: В 2021 году была продолжена работа по выяснению роли белкового фактора eIF4G2 (или DAP5)в преодолении ингибиторного эффекта т.наз. Коротких Рамок Считывания (КРС)на трансляцию следующих за ними с основных рамок считывания у целого ряда мРНК млекопитающих. Предложена гипотеза о том, что некоторые КРС приводят к потере сканирующими 40S рибосомами основного кеп-зависимого сканирующего фактора, eIF4G1, и замене его на кеп-независимый гомологичный фактор eIF4G2. Тем самым достигается "спасение" сканирующих 40S рибосом и достижение ими инициирующих кодонов основных рамок считывания. Это особенно характерно для мРНК, кодирующих регуляторные белки, клеток млекопитающих. Нарушение синтеза регуляторных белков приводит к различным болезням, включая онкологические. Полученные данные легли в основу подготовленной статьи, которая, как мы считаем, в силу важности полученных результатов, должна быть опубликована в журнале с высоким рейтингом. Сделать это, даже в случае прорывных открытий, в настоящее время не так-то просто. В конце концов, статью приняли на рассмотрение в журнал Nucleic Acids Research (импакт фактор > 16.00), получены отзывы четырех рецензентов, которые оценивают полученные результаты достаточно высоко и следовательно есть надежда, что работа будет опубликована еще в этом году. В настоящее время проводятся некоторые уточняющие эксперименты, затребованные рецензентами этой работы. Кроме этого, по тематике данной НИР только что опубликован приглашенный обзор в сборник , посвященный памяти академика А.С. Спирина, в журнале Биохимия: Modifications of Ribosome Profiling that Provide New Data on the Translation Regulation. Biochemistry (Moscow), 86, №9, 1095-1106, 2021 DOI: 10.1134/S0006297921090054. Тема обзора очень интересная и актуальная, так что есть надежда, что обзор будет хорошо цитироваться. Andreev Dmitry E., Smirnova Victoriya V., Shatsky Ivan N.
10 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа: Работа велась как и ранее по двум основным направленим: 1) Исследование функциональной роли фактора инициации трансляции eIF4G2 и 2) функциональная роль хозяйских белков в функционировании IRES-элементов в РНК энтеровирусов: Роль белка глицил-тРНК синтетазы. По первой теме удалось совершить серьезный прорыв. В начале 2022 года в высокорейтинговом журнале Nucleic Acids Research вышла наша статья, где впервые была описана функциональная роль белкового фактора инициации трансляции eIF4G2 в механизме сканирования 40S рибосомой 5'-нетранслируемых последовательностей (5'НТО) мРНК у высших эукариот, включая млекопитающих. Оказалось, что этот фактор, по поводу которого в течение 25 лет строились всякие фантазии, на самом деле выполняет существенную роль в успешном достижении 40S рибосомой основного стартового кодона на разных длинных 5'НТО, содержащих лишние короткие, так-называемые upstream рамки считывания. Оказалось, что на таких рамках, часть сканирующих комплексов превращается в элонгирующие 80S рибосомы, считывающие последовательность этих рамок, а другая часть сканирующих комплексов пропускает инициирующий кодон этих коротких рамок и продолжает процесс сканирования в поисках главного стартового кодона, инициирующего считывание основной нуклеотидной последовательности, кодирующей тот или иной клеточный белок. По всей вероятности, в пределах upstream рамок между элонгирующими 80S рибосомами и сканирующими 40S комплексами происходят столкновения, которые приводит к потере белкового фактора eIF4G1, одного из ключевых белков, необходимых 40S рибосомам для процесса сканирования. В этот момент eIF4G1 заменяется фактором eIF4G2, который гомологичен eIF4G1, но лучше удерживается на 40S рибосомах, и в конце-концов позволяет сканирующим 40S комплексам достичь своей цели, то есть основного стартового кодона у соответствующей мРНК. Это новый, еще никем неописанный фундаментальный механизм, используемый на начальном этапе инициации трансляции у многоклеточных эукариот. Мы назвали этот механизм "Механизмом смены лошадей". Оказалось, что короткие upstream reading frames являются, скорее всего, не единственным препятствием на пути сканирующих комплексов, вероятно в качестве препятствий могут быть какие-то структурные элементы в пределах 5'НТО, которые также приводят к замене eIF4G1 на eIF4G2. Эта тема развивается в статье Shestakova ED et al 2022, опубликованной в американском журнале 1-ого квартиля RNA. Что касается второго направления в наших исследованиях, исследования роли глицил-тРНК-синтетазы (GARS) в инициации трансляции на IRES-элементах энтеровирусов (включая вирус полиомиелита), то здесь мы пришли к выводу, что GARS работает на IRES-элементе не один, а в тесном взаимодействии с другими белками клетки-хозяина, в частности с белками UNR и UNRIP. Эта работа была также опубликована в журнале 1-ого квартиля International Journal of Molecular Sciences, изд. MDPI (Basel).
11 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа: За период с 1 января 2023 года по 31 декабря 2023 года Лаборатория Регуляции Синтеза Белка в основном занималась углублением знаний о функциях фактора инициации eIF4G2. Было установлено, что этот фактор, о котором в течение более 25 лет писали всякие фантазии, играет чрезвычайно серьезную роль в предотвращении разного рода сбоев во время процесса сканирования 5'-нетранслируемых последовательностей (5'НТО) мРНК высших эукариот. Появление в эволюции этого белка у высших эукариот связано с особой сложностью и протяженностью 5'НТО у животных. В частности, eIF4G2 исправляет сбои во время сканирования, когда сканирующие комплексы наезжают на короткие открытые рамки считывания, на которых идет синтез полипептидов, или когда они . сталкиваются с какими-либо с трудно преодолимыми структурными препятствиями. Наконец, в 2023 году этот научный коллектив нашел еще одну удивительную функцию у фактора eIF4G2. Оказалось, что он способен обеспечивать двойное кодирование, то есть считывание с одной нуклеотидной последовательности двух белков в разных рамках считывания.
12 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Изучение структуры информационных РНК и их комплексов с рибосомами
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".