| 1 |
6 ноября 2014 г.-31 декабря 2014 г. |
Разработка высокопроизводительной системы для выявления антибактериальных препаратов |
| Результаты этапа: Проведен анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы по теме «Методы скрининга механизмов действия антибактериаль-ных соединений», выполнены патентные исследования в соответствии ГОСТ Р15.011-96, созданы варианты репортерных штаммов, способных реагировать на множество структурных классов антибактериальных препаратов, объединенных общей мишенью, биосинтезом белка.
Разрабатываемый метод основан на использовании штаммов бактерий с плазми-дой, содержащей гены двух белков. Экспрессия одного белка используется в качестве внутреннего контроля. Экспрессию второго белка с помощью опреде-ленного механизма можно связать с конкретным воздействием на клетку. Для того, чтобы связать экспрессию репортерного гена со скорость трансляции мы обратились к природному примеру регуляции экспрессии гена, основанной на скорости трансляции, классический пример – триптофановый оперон E. coli, ре-гулируемый по механизму аттенюации. Взяв за основу вышеописанную систе-му, а в качестве репортерных генов – гены двух люцифераз Fluc и Rluc (белки при гидролизе субстрата приводят к люминесценции). Экспрессия Rluc была по-стоянной, а перед Fluc мы поместили последовательность лидерного пептида trpL и получили конструкцию, в которой экспрессия Rluc – постоянная, а Fluc – зависит от концентрации триптофана. Затем два триптофановых кодона были заменены на два аланиновых, которые рибосома всегда транслирует быстро. При обычных условиях это должно приводить к ингибированию экспрессии Fluc. В присутствии же антибиотика, замедляющего трансляцию (в сублеталь-ной концентрации), рибосома будет все равно медленно транслировать участок с двумя аланиновыми кодонами, что приведет к сворачиванию альтернативной вторичной струк-туры и увеличению экспрессии Fluc.
Созданная системы была протестирована на ряде модельных антибиотиков, за-медляющих трансляцию, и ее адекватность была подтверждена, однако, необхо-димость разрушения клеток для детекции сигнала и использование двух специ-фических субстратов – значительно усложняло и увеличивало стоимость экспе-риментов и затрудняло использование данной конструкции в широкомасштаб-ных анализах. Вместо генов люцифераз, мы решили использовать гены флуо-ресцентных белков (красного RFP и цианового CER). Использование флуорес-ценции позволяет проводить все эксперименты in vivo и детектировать сигнал непосредственно в клетках без использования дополнительных реагентов.
Подобная система не имеет прямых аналогов в мире. В настоящий момент ис-пользуется достаточно много репортерных систем, позволяющих обнаруживать известные классы антибиотиков. Обычно репортерный белок находится под контролем промотора, активируемого соответствующим антибиотиком. Так, об-наружение тетрациклинов проводится при помощи специфического репрессора мобильного элемента Tn10. Сходным образом обнаруживаются бета-лактамные антибиотики, используя ampR/ampC гены Citrobacter freundii. Макролидные ан-тибиотики можно обнаружить с помощью MphR репрессора из штамма Escherichia coli Tf481A или индукции метилтрансферазы, вызывающей устой-чивость к макролидам. У всех этих методов это достаточно узкая специфичность по отношению к определенному, уже известному классу соединений. В на-стоящее время практически отсутствуют системы скринига, позволяющие сразу идентифицировать мишень антибактериального соединения, и в тоже время не ограниченного поиском новых представителей уже известных классов антибио-тиков.
Целесообразным является разработка системы поиска антибактериальных пре-паратов –веществ-ингибиторов биосинтеза белка, основанной на генетически модифицированном репортерном штамме. В качестве такого штамма необходи-мо использовать tolC штамм, трансформированный репортерной конструкцией на основе модифицированного триптофанового оперона, в котором триптофано-вые кодоны заменены на аланиновые. Для детекции остановки биосинтеза белка предпочтительно использовать экспрессию генов флюоресцентных белков с раз-личаемыми спектрами флюоресценции, таких, как RFP и CER. Среди созданных штаммов RFPCER, TrpL и TrpL2A оптимальным штаммом для детекции анти-биотиков, ингибирующих биосинтез белка, следует признать штамм TrpL2A. |
| 2 |
1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Разработка высокопроизводительной системы для выявления антибактериальных препаратов |
| Результаты этапа: Создан двойной репортерный штамм (pDualrep2) на основе двух флуоресцентных белков, которые можно детектировать независимо. Количество одного из белков зависит от присутствия антибиотиков, вызывающих замедление трансляции, количество второго увеличивается в присутствии ДНК-повреждающих агентов. Были выбраны два белка – RFP и Katushka2S, так как их можно независимо детектировать при помощи системы ChemiDoc. Была показана высокая чувствительность данной системы. Возможно детектировать контрольные антибиотики в количестве, меньшем или равным 1 мкг, сигнал проявляется за 16 часов и остается постоянным и не меняется по меньшей мере до 72 часов. Были проанализированы более пяти тысяч потенциальных антибиотиков, среди которых обнаружены соединения, индуцирующие репортерную систему. В дальнейшем механизм их действия будет изучен более детально, в рамках Завершения испытаний системы поиска антибактериальных препаратов – веществ-ингибиторов биосинтеза белка по разработанной программе и методикам испытаний, запланированном на 4 этап выполнения проекта.
Начаты испытания системы поиска антибактериальных препаратов –веществ-ингибиторов биосинтеза белка по разработанной программе и методикам испытаний. Выполнены пункты 4.1-4.5, 4.7-4.9. Создана инструкция по применению набора для тестирования потенциальных антибактериальных препаратов – веществ-ингибиторов биосинтеза белка.
Проведены все необходимые теоретические и экспериментальные работы.
Подведены итоги третьего этапа НИР.
Разработан и рассмотрен на учёном совете промежуточный отчет о НИР.
|
| 3 |
1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Разработка высокопроизводительной системы для выявления антибактериальных препаратов |
| Результаты этапа: На пятом этапе выполнения проекта мы протестировали набор из 7500 производных трех лидерных соединений, отобранных на этапе первичного скрининга. Для валидации Системы поиска антибактериальных препаратов –веществ-ингибиторов биосинтеза белка, основанной на генетически модифицированном репортерном штамме, соединения, индуцирующие репортерный ген Katushka2S, что сигнализировало об активности соединений в ингибировании биосинтеза белка, были проверены с помощью независимого метода – бесклеточной системы биосинтеза белка. Оказалось, что 15 из 16 соединений (93 %), приводящих к более, чем двукратной индукции репортера Katushka2S, подавляют внеклеточную систему трансляции не менее, чем в 4 раза. На пятом этапе были подведены итоги работы, проведены дополнительные патентные исследования и составлены необходимые для дальнейшего внедрения разработанной системы документы, такие, как Техническое задание на проведение ОКР, Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера -организации реального сектора экономики АО «ИИХР». На разработанную Систему подана патентная заявка. До получения патента, с Индустриальным партнером проекта АО «ИИХР» было заключено дополнительное соглашение к договору о софинансировании и дальнейшем использовании результатов прикладных научных исследований по теме «Разработка высокопроизводительной системы для выявления антибактериальных препаратов»
За счет внебюджетных средств индустриального партнера проведено тестирование токсичности всех соединений, отобранных с помощью Системы поиска антибактериальных препаратов – веществ-ингибиторов биосинтеза белка, основанной на генетически модифицированном репортерном штамме, по отношению к клеткам человека.
Проведены все необходимые теоретические и экспериментальные работы.
Подведены итоги пятого этапа НИР.
Разработан и рассмотрен на учёном совете промежуточный отчет о НИР.
Разработана отчетная документация в соответствии с требованиями настоящего технического задания и актов Заказчика.
|
