ИСТИНА

Сложность изучения функциональной роли конкретных калиевых каналов в естественном биологическом окружении связана с ограниченной селективностью известных модуляторов их активности, а для ряда каналов - с отсутствием высокоселективных лигандов. Для детального изучения функциональной роли калиевых каналов с учетом их индивидуальных особенностей, для выявления уровня экспрессии и активности этих каналов в клетках и тканях в норме и патологии нужны новые молекулярные инструменты (в том числе флуоресцентные). Разработка этих молекулярных инструментов может вестись на основе высокоаффинных и селективных лигандов этих каналов. Целью проекта является изучение молекулярных основ селективности взаимодействия пептидных лигандов с калиевыми каналами, разработка принципов и способов конструирования селективных высокоаффинных пептидных блокаторов калиевых каналов с использованием оригинальных разработок на основе современных методов молекулярного моделирования, биоинженерии, протеомики и флуоресцентной микроскопии. Поставленная задача будет решаться на примере представителей потенциал-зависимых калиевых каналов Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.6, представителей кальций-активируемых калиевых каналов КСа2.3 , КСа3.1 и представителя каналов входящего выпрямления Kir1.1. Успешное решение задачи для этих каналов подтвердит применимость и создаст условия для масштабного использования разработанных методических подходов в исследованиях других эукариотических калиевых каналов.

Complicacy in the study of functional role of definite potassium channels in natural biological environment is related to restricted selectivity of known modulators of their activity or even to absence of highly selective ligands. New molecular instruments (including fluorescent ones) are required to study in detail a functional role of potassium channels and to reveal expression and activity levels of these channels in cells and tissue in normal and pathogenic states. Development of such molecular instruments can be carried out on the basis of highly active and selective channel ligands. The aim of the project is the study of molecular basis for selectivity of interactions between peptide ligands and potassium channels, the development of principles and means for design of selective high-affinity potassium channel peptide blockers using original approaches based on the state-of-the-art molecular modeling, bioengineering, proteomics and fluorescent microscopy techniques. This task will be solved for the representatives of voltage-gated potassium channels Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.6, the representative of calcium-activated potassium channels КСа2.3 , КСа3.1 and the representative of inwardly rectifying potassium channels Kir1.1. Successful solution of the task for these channels will confirm applicability of the developed methods to the extended study of other eukaryotic potassium channels also.

Изучение молекулярных основ, определяющих селективность взаимодействия лигандов с конкретными типами каналов, и систематизация этих данных для различных типов каналов позволит разработать научно-обоснованные принципы направленной коррекции активности каналов, предложить новые способы создания селективных блокаторов, которые смогут найти широкое применение в исследовательской и медико-биологической практике. Конструируемые пептидные блокаторы призваны стать молекулярными инструментами для изучения: тканеспецифичных функций целевых ионных каналов, вовлеченности этих каналов в развитие различных заболеваний, возможности избирательной коррекции анормальной гиперактивности целевых каналов, применимости селективных пептидов-блокаторов при терапии социально-значимых заболеваний. Полученные результаты будут опубликованы в виде серии научных статей.

Участники проекта имеют многолетний опыт работы в области молекулярного моделирования. К области нашей компетенции относятся моделирование структуры белков и пептидов, комплексов белков с лигандами, а также белок-липидных систем, имитирующих биологические мембраны. На примере канала Kv1.3 отработана методика моделирования структуры калиевых каналов по гомологии с известной структурой канала Kv1.2 и других родственных каналов. Отработана методика моделирования структуры пептидов как по гомологии с уже известными структурами сходных пептидов, так и ab initio. Отработана методика белок-белкового докинга для получения моделей комплексов калиевых каналов с петидами. Разработаны протоколы молекулярно-динамических расчетов систем «липидный бислой + канал + пептид» для моделирования связывания пептидов с каналами. Участниками проекта разработаны оригинальные клеточные системы поиска и исследования поровых блокаторов калиевых каналов. Системы включают в себя: (1) сферопласты E.coli, презентирующие на мембране гибридные белки KcsA-Kv1.x, сконструированные путем встраивания лиганд-связывающих сайтов калиевых каналов человека Kv1.x в гомологичный участок бактериального канала KcsA; (2) высокоаффинный флуоресцентно-меченный лиганд - агитоксин 2; (3) методику измерения констант связывания анализируемых лигандов с сайтами связывания Kv1.x-каналов в составе гибридных белков на мембране сферопластов с применением метода конфокальной микроскопии. Эти клеточные системы позволяют количественно оценивать избирательность связывания лиганда с поровой петлей различных калиевых каналов, обнаруживать высокоаффинные поровые блокаторы каналов Kv1.x, как среди индивидуальных органических соединений и пептидов, так и в сложных смесях, таких, как яды членистоногих. Для поиска высокоаффинных лигандов ионных каналов в ядах членистоногих предложен и успешно апробирован новый протеомный подход.

Комплексный подход к изучению молекулярных основ взаимодействия пептидных блокаторов с каналом, разработанный нами в процессе выполнения проекта, включает современные методы молекулярного моделирования, биоинженерии, протеомики и флуоресцентной микроскопии. Основу наших исследований составляет применение биоинженерных способов представления лиганд-связывающих сайтов калиевых каналов в составе гибридов с каналом KcsA, а также флуоресцентные методы детекции взаимодействия этих сайтов с пептидными блокаторами. Разработанные нами биоинженерные системы, позволяющие рассчитывать величину Kd и, таким образом, количественно оценивать аффинность блокатора, были успешно применены для изучения блокаторов каналов Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.6 и KCa3.1. Комплексный подход позволил решить масштабные научные задачи: - выявление молекулярного разнообразия пептидных блокаторов яда скорпиона Mesobuthus eupeus с использованием транскриптомных и пептидомных баз данных; - установление интерфейса взаимодействия нейрональных потенциал-зависимых каналов Kv1.1 и Kv1.6 с пептидными блокаторами яда скорпиона (семейства α-KTX3) с привлечением данных молекулярного моделирования, а также экспериментальных данных по взаимодействию модельных гибридных каналов с пептидными блокаторами и их мутантными, исследование избирательности взаимодействия пептидов с поровой частью калиевых каналов; - создание нового типа флуоресцентных блокаторов калиевых каналов - а именно, генокодируемых флуоресцентно-меченых пептидных блокаторов. Блокаторы этого типа созданы на основе биоинженерного конструирования рекомбинантных молекул, в которых флуоресцентные белки eGFP и RFP слиты с N-концевой последовательностью пептидного блокатора. Активность двух таких блокаторов - eGFP-OSK1 и RFP-AgTx2 - в отношении целевых потенциал-зависимых калиевых каналов Kv1-семейства была успешно подтверждена тестированием на панели модельных каналов флуоресцентными методами, а также на панели эукариотических каналов методами электрофизиологии. Преимуществами этого типа блокаторов является детерминированность их структуры, возможность быстрого и простого получения больших количеств флуоресцентного лиганда. Блокаторы могут быть использованы для целей скрининга калиевых блокаторов (например, при поиске новых блокаторов в ядах животных - многокомпонентных смесях природного происхождения), а также для визуализации калиевых каналов при изучении их активности и клеточной/тканевой локализации; - разработка и создание методом биоинженерии универсального подхода к супер-продукции рекомбинантных дисульфид-богатых пептидных блокаторов с выходом активного пептида от 12 до 22 мг в расчете на 1 л культуры; - создание ряда мутантных форм пептидных блокаторов на основе структуры агитоксина 2 (AgTx2) с повышенной аффинностью и селективностью к каналу Kv1.3 - новой терапевтической мишени аутоиммунных заболеваний.