| Результаты этапа: 4.1. Ранее мы установили, что в цитоплазме клеток печени присутствует специфическая фракция нуклеозиддифосфаткиназы (НДФК), составляющая менее 10% общей активности этого фермента в цитоплазме, которая способна связываться с наружной мембраной митохондрий (мНДФК). При изучении свойств мНДФК было установлено, что около 20 – 25% активности фермента участвуют в функциональном сопряжении с системой окислительного фосфорилирования. Специфическая функция остальных молекул мНДФК до настоящего времени не известна. С целью выяснения этой функции мы проводим сравнительное изучение физико-химических свойств мНДФК и цитоплазматической НДФК (цНДФК).
В 2014 г. начато изучение кинетических параметров цНДФК и двух фракций мНДФК: участвующей и не участвующей в функциональном сопряжении с системой окислительного фосфорилирования. Разработан метод рН-метрической регистрации активности фермента. Физиологическое направление реакции: АТР + NDP ↔ ADP + NTP, где NDP и NTP – один из нуклеоздди- или -трифосфатов соответственно. рН-метрический метод был выбран потому, что обычные спектрофотометрические методы определения АТР с использованием сопряженной ферментной системы гексокиназа (ГК) + глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа или метод определения ADP в системе с пируваткиназой (ПК) и лактатдегидрогеназой невозможно было использовать по причине недостаточной субстратной специфичности ГК и ПК, которые могут вступать в реакцию не только с АТР или ADP, но и с другими NTP или NDP соответственно.
В разработанном нами методе в качестве сопряженной ферментной системы выступает креатинкиназная реакция: ADP + фосфокреатин + Н+ ↔ АТР + креатин. Креатинкиназа обладает высокой субстратной специфичностью в отношении АТР и ADP. Протекание НДФК реакции практически не сопровождается изменением рН среды; в то же время, как видно из уравнения креатинкиназной реакции, протекание реакции приводит к закислению среды. При физиологических значениях рН отношение ADP/Н+ = 1. По изменению рН среды инкубации можно рассчитать количество вступившего в реакцию ADP и таким образом регистрировать активность НДФК.
Получены предварительные результаты по определению кинетических параметров цНДФК.
|
