Эпигенетические системыНИР

Epigenetic systems

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Эпигенетические системы
Результаты этапа: В 2014 г. нами установлено, что в культурах клеток бронхиального эпителия человека тетрапептид бронхоген ADEL регулирует синтез белков Ki67, Mcl-1, p53, CD79, NOS-3. Это способствует активации процессов клеточного обновления и повышению функциональной активности клеток бронхиального эпителия. Тетрапептид активирует экспрессию генов дифференцировки клеток бронхиального эпителия Nkx2.1, SCGB1A1, SCGB3A2, FoxA1, FoxA2, а также генов MUC4, MUC5АС, SftpA1, снижение экспрессии которых коррелирует с развитием хронического бронхита. Инкубация клеток бронхиального эпителия человека в присутствии пептида бронхогена ADEL приводит к утрате метилирования CpG сайтов в промотерах разных генов. Предложен новый механизм регуляции экспрессии генов короткими пептидами. В основе такой регуляции может быть взаимодействие пептида с СpG сайтами промотера. Это блокирует метилирование промотера, оставляя его неметилированным, что необходимо для активации транскрипции многих генов. Пептид ADEL эффективен и безопасен при пероральном применении в комплексном лечении пациентов с хроническим бронхитом в стадии ремиссии. После применения тетрапептида у больных нормализуются показатели внешнего дыхания. Для создания микробных продуцентов фармацевтических стероидов на основе актинобактерий Mycobacterium smegmatis проведена работа по модификации кассеты экспрессии, встроенной в вектор pMynt/Triple, обеспечивающий коэкспрессию гетерологических белков (цитохрома Р450scc, AdR и Ax): а) с целью повышения уровня экспрессии белков Р450scc-системы изменено расположение кДНК, кодирующих белки ХГЛ системы, в составе полицистронной кассеты и б) с целью повышения активности Ax кДНК, кодирующая делетированную форму Ах(4-108), заменена нуклеотидной последовательностью, кодирующей полноразмерный мутантный Aх (1-112, S112W). Для изучения возможности использования полицистронных векторов, включающих последовательности саморасщепляющегося белка 2А, для коэкспрессии белков P450scc-системы быка в клетках прокариотических и эукариотических микроорганизмов получены рекомбинантные плазмиды Fluc/P450.delAx (для проведения экспериментов по транскрипции-трансляции в прокариотической бесклеточной системе в условиях in vitro) и pYeDP/mHGL (для проведения экспериментов по коэкспрессии белков in vivo) и рекомбинантные штаммы дрожжей S. cerevisiae/pYeDP/mHGL. Проведен анализ полученных плазмид (рестриктный анализ и секвенирование) и рекомбинантных штаммов (идентификация гетерологических белков и оценка эффективности расщепления белка 2А). Продолжено изучение биологических эффектов экстрактов из мицелия вешенки Pleurotus ostractus, а также выделенного и идентифицировано биологически активного начала, являющегося производным стерола - 4-hydroxy-17R-methylincisterol (инцистерол) Проведено детальное цитологическое и биохимическое исследование действия фракций водно-этанольного экстракта и интестинола на дислипидемию у крыс, вызванную атерогенной диетой. На модели стеатоза, индуцированного атерогенной диетой у подопытных крыс, показано, что фракция экстракта, обогащенная этой субстанцией, обладает гепатопротекторными свойствами. Гепатопротекторный эффект заключается в нейтрализации патологического действия атерогенной диеты на развитие жировой дистрофии гепатоцитов и в нормализации общей гистологической организации печени. Полученные результаты - основа для разработки препаратов, направленных на снижение побочного действия токсических лекарств, являющихся одной из наиболее актуальных задач современной биотехнологии, медицины и фармакологии, в частности при онкологических заболеваниях. Установлена связь между морфологией и уровнями организации хроматина в выделенных ядрах при различных концентрациях ионов магния и их КД в отсутствие и присутствии антибиотика дистамицина. Сделан вывод о том, что экстракция гистона Н1. из ядер посредством полиглутаминовой кислоты отражает его гетерогенную и структуро-зависимую локализацию. Начато изучение термодинамики взаимодействия дистамицина с хроматином в ядрах в различных условиях в сравнении с выделенным хроматином и ДНК в растворах. Изучено влияние модуляции уровня метилирования ДНК в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе с помощью диеты, в разной степени обогащенной источниками метильных групп, на интенсивность аудиогенных судорожных припадков (АСП) у крыс, селектированных по признакам отсутствия АСП (линия “0”) и их высокой интенсивности (линия “4”). Оценивали уровни метилирования в мозге крыс для группы генов, чувствительных к экспериментальным манипуляциям с эпилептическим статусом у мышей. Показано, что уровень метилирования многих генов не изменяется в зависимости от чувствительности к АСП и характера диеты (гены Irа4, Mta1, Hspa1b и Tcfap2e) У ряда других генов были обнаружены межлинейные различия, и изменение уровня метилирования в зависимости от обогащения диеты источниками метильных групп (гены Cpne6, Scrt1, Gtf2i и Sfmbt2). Полученные результаты имеют существенное значение для понимания механизмов возникновения судорожных припадков, а также разработки методов их лечения. Исследована возможность использования протоковых клеток слюнных желез для целей заместительной терапии повреждений печени. Показано, что эти клетки сходны с прогениторными клетками печени по характеру экспрессии генов в масштабах полного транскриптома. В частности клетки обоих указанных типов экспрессируют такие поверхностные маркеры как EpCAM, CD29, c-Kit, Sca-1 и c-Met, а также цитокератины 8, 18, и 19, альфа-фетопротеин и альбумин. В то же время, в отличие от клеток печени, клетки слюнных желез экспрессируют цитокератин 14 и CD49f, характерные для протоков слюнных желез. Обнаружено также заметное сходство между данными типами клеток по характеру экспрессии генов ряда факторов транскрипции, хотя в этом отношении клетки слюнных желез имеют более заметное сходство с экзокринными клетками поджелудочной железы.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Эпигенетические системы
Результаты этапа:
4 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Эпигенетические системы
Результаты этапа: Исследованы экспрессия и характер метилирования генов ДНК-метилтрансфераз в органах растений. Гены главных поддерживающих ДНК-метилтрансфераз, MET1 и CMT3, и главной ДНК-метилтрансферазы de novo-типа, DRM2, на высоком уровне экспрессируются во всех органах. В развивающемся эндосперме гены MET1 и CMT3 экспрессируются существенно слабее, а гены MET2a, MET2b, MET3 и CMT2, наоборот, гораздо активнее. Гены CMT1 и DRM1 во всех органах экспрессируются очень слабо. Характер метилирования большинства исследованных генов соответствует прототипу «ген с метилированной структурной областью». Отличительной чертой генов семейства MET является метилирование по сайтам всех трех типов. Самые слабо экспрессирующиеся гены, CMT1 и DRM1, практически не метилированы. Гены MET3 и N6AMT имеют необычные паттерны метилирования: полностью неметилированные промоторную и большую часть структурной области и довольно сильно метилированную 3’-концевую часть структурной области. 2. Создана тест-система для определения аномалии упаковки хроматина сперматозоидов человека в рамках диагностики мужского бесплодия. Она доступна для андрологических клиник и центров репродукции, поскольку не требует использования дорогого оборудования и специально подготовленного персонала, работает в режиме экспресс-анализа (около 2 часов) и обладает прогностическим эффектом для выбора стратегии лечения, например методами антиоксидантной терапии. Получены патенты. Документы находятся на рассмотрении Росздравнадзора для рекомендации использования разработанной тест-системы в медицинской практике. 3. Показано, что десметилинцистерол (ДМИ), выделенный нами ранее из гриба вешенки, а затем синтезированный химическим путем, зависимо от дозы индуцирует апоптоз в трансформированных, но не в нормальных клетках человека в культуре, а также усиливает апоптотические эффекты цитостатиков, используемых в химиотерапии онкологических заболеваний. Тем самым доказано, что ДМИ можно использовать как препарат сопровождения при химиотерапии, позволяющий уменьшить токсические эффекты цитостатиков без уменьшения их эффективности в отношении раковых клеток. 4. Продолжена работа по оптимизации систем биотрансформации холестерина в прегненолон для последующего создания биотехнологических систем синтеза стероидных соединений. 5. Изучены термодинамические характеристики взаимодействия природного полипептидного антибиотика дистамицина А с хроматином в изолированных ядрах печени крыс. Рассматривается возможность использования метода для тестирования фармацевтических препаратов в условиях, наиболее приближенных к ситуации in vivo. 6. Изучено влияние экзогенные биологически активных коротких пептидов на рост, развитие и дифференцировку каллусной культуры табака. Показано, что они увеличивают рост каллусной массы и стимулируют формирование и рост листьев. Изученные пептиды модулируют в клетках табака экспрессию генов, в том числе, отвечающих за формообразование и клеточную дифференцировку.
5 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Эпигенетические системы
Результаты этапа: 1. Изучена экспрессия химерных трансгенов pcDNA3.1_Р450scc-2A-GFP и реконструированной стероидогенной системы Р450scc/Adx/AdR в клет- ках человека. Показано, что гетерологичная система Р450scc обеспечивает эффективную трансформацию стероидов с образованием прегненолона. 2.Проведена дальнейшая оптими P450scc–2A–Adx-2А-AdR (mHGL), включаю- щего белки-компоненты энзиматической Р450scc системы быка. 3. Изучено взаимодействий рекомбинантных белков стероидогенной Р450-scc cистемы со стероидными флуоресцирующими низкомолекулярными соединениями 4. С использованием плазмид р67/Adx, р67/CYP17α и р67/P450scc–2A–Adx- 2А-AdR, обеспечивающих совместную экспрессию белков ХГ/Л системы и цитохрома Р45017α, получены трансгенные штаммы на основе липофиль- ных дрожжей Y. lipolytica, способных поглощать стероидные соединения. 5.Продолжены исследования апоптогенного препарата десметилинцистеро- ла (ДМИ). Показано, что синтетический ДМИ резко индуцирует апоптоз в раковых клетках линии HeLa и не действует на нормальные нетрансформи- рованные клетки. Индукция апоптоза реализуется активацией транскрип- ции проапоптозных генов 6. Получено разрешение Федеральной службыпо надзору в сфере здравоохранения (РОСДРАВНАДЗОР) от 26.07.2017г. на проведение клинических испытаний медицинского изделия «Набор реагентов для определения аномалии упаковки хроматина сперматозоидов человека с использованием микрококковой нуклеазы ”Набор реагентов TAPS” по ТУ 9398-001-11620013-2016». 7. Получен патент на изобретения № 2634384 «Применение препарата ”Экстракт мицелия вешенки ”ревитацел” на основе штамма гриба Pleurotus ostreatus ВКПМ f-819, влияющего на мужскую репродуктивную функцию» Дата публикации патента: 26 октября 2017 г. Изобретение относится к медицине (андрология, репродукция) и касается применения лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище на основе грибных продуцентов, влияющих на мужскую репродуктив- ную функцию, и предназначено для восстановления и сохранения фертиль- ности сперматозоидов человека при их исходной сниженной подвижности - астенозооспермии. 8. Определены термодинамические параметры взаимодействия противоопухолевого антибиотика дистамицина с изолированными ядрами печени крысы. 9. Проведено исследование эндогенного гормонального статуса и ответа на экзогенные фитогормоны у трансформантов картофеля. Предложена базовая модель гормонального контроля клубнеобразования. 10. Протестирована функциональная активность связанных с эндоплазматическим ретикулюмом цитокининовых рецепторов у Arabidopsis taliana. Показано, что рецепторы цитокининов, локализованные в ЭР, активно участвуют в сигнальной трансдукции цитокининов. Предложена модель пространственной организации транспорта цитокинина. 11. Предложена модель эпигенетического механизма старения на основе «горячих то- чек» дезаминирования метилированных динуклеотидов m5CG в кодоне CGA аргинина с образованием стоп-кодонов TGA. 12. Исследована экспрессия широкого круга генов, связанных со старением, в делящихся (старение по Хейфлику) и стационарных клеточных культурах.
6 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Эпигенетические системы
Результаты этапа: 1. Разработана и оптимизирована система биотрансформации стероид- ных соединений в трансгенных клетках человека (клеточная линия HEK293) и липофильных дрожжей Y. lipolytica, экспрессирующих цитохром Р450scc (основной компонент стероидогенной холестеролгидроксилазной/лиазной системы), и/или полную стероидогенную Р450scc-систему быка (Р450scc/Adx/AdR). По материалам подготовлена статья для публикации. 2. Показано, что ди- стамицин индуцирует структурные переходы в хроматине ядер, связанные с повышением торзионного напряжения ДНК. Это значительно усиливает взаимодействия между нитями ДНК. Разработанная модель может служить прототипом для тестирования механизмов действия антибиотиков и других веществ на уровне клеточного ядра. 3. Исследованы молекулярные меха- низмы апоптогенного действия десметилинцистерола на раковые клетки. Показано, что он преодолевает блокаду апоптозов в таких клетках, изменяя баланс между экспрессией про-апоптогенных и анти-апоптогенных факто- ров в пользу про-апоптогенных. В нормальных клетках такого эффекта не наблюдается, что и объясняет их резистентность к апоптогенному действию ДМИ. 4. Доказана роль ассоциированных с эндоплазматическим ретикулю- мом цитокининовых рецепторов в передаче сигналов цитокининов. Иссле- дована лигандная активность различных производных N6-бензиладенина в отношении различных изоформ цитокининового рецептора, обнаруже- ны производные, проявляющие селективность в отношении одной из форм рецептора. Обнаружены и исследованы цитокининовые рецепторы у кар- тофеля. 5. Исследована экспрессия генов, активность которых существен- на для старения кожи, в первичных культурах фибробластов кожи чело- века при действии каротиноида фукоксантина. Показано, что в оптималь- ной концентрации фукоксантин заметно стимулирует экспрессию генов, ко- дирующих определенные белки защитных систем (SOD2, TXNRD1, ERCC5 и GADD45A), белки межклеточного матрикса дермы (ELN, FN1, LAMA3, LAMB3, LAMC2) и белки-субъединицы мембранных рецепторов интегри- нов. Эта регуляция осуществляется на эпигенетическом уровне путем пе- рераспределения активирующих (H3K4me3) и ингибирующих транскрип- цию (H3K27me3 и H3K9me3) эпигенетических меток. Таким образом фукок- сантин на эпигенетическом уровне защищает клетки кожи от старения. 6. Показано, что способность клеток к накоплению холестерина зависит от природы мутаций митохондриальной ДНК. 7. Показано, что возникновение атеросклеротических повреждений в артериальных стенках не коррелирует с копийностью мтДНК, но ассоциированна с повышением степени гетеро- плазмии по мтДНК.
7 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Эпигенетические системы
Результаты этапа: 1. В стареющих делящихся и стационарных культурах мезенхимальных стволовых клеток человека наблюдаются закономерные изменения в уровнях экспрессии генов, играющих роль в старении («геронтогенов»). Короткие биологически активные пептиды по-разному модулируют экспрессию этих генов в зависимости от возраста и пролиферативной активности клеток. 2. Развитие мужского и женского гаметофитов у цветковых растений сопряжено с масштабными эпигенетическими изменениями (репрограммированием эпигенома), формирующими эпигенетический ландшафт для начальных этапов развития следующего поколения растения (спорофита). В клетках гаметофитов, не участвующих в передаче генетической информации спорофиту, происходит активация транспозонов и синтез комплементарных малых интерферирующих РНК. Эти миРНК транспортируются в гаметы и обеспечивают надежную инактивацию транспозонов, предохраняя геном будущего спорофита. 3. Связываясь с определенными остатками лизина в молекулях гистонов Н1 и Н3, тетрапептид AEDL индуцирует превращение гетерохроматина в эухроматин в каллусах табака. 4. Твердая пшеница сорта Оренбургская 10 и мягкая пшеница сорта Оренбургская 22 имеют разную устойчивость к длительному засолению, основанную на уровнях экспрессии генов K+/Na+ транспортеров семейств HKT1;4 и HKT2;1 генов супероксиддисмутазы SOD и бифункционального фермента Nfn, катализирующего восстановление НАДФ. 5. Клубнеобразование у картофеля регулируется активностью фитогормональных систем, в первую очередь, гиббереллинов и ауксинов. Манипулируя активностью этих систем в клубнях с помощью трансгенных конструкций, можно в желаемом направлении изменять интенсивность клубнеобразования без заметного ухудшения других функциональных характеристик растения. 6. Нами осуществлена успешная экспрессия стероидогенной системы Р450scc млекопитающих в клетках различных микроорганизмов. Полученные системы экспрессии могут послужить основой для биотехнологического производства стероидных препаратов в фармацевтической промышленности. 7. Мы обнаружили специфические необычные изоформы белка тафаззина, играющего ключевую роль в ремоделировании специфического для митохондрий фосфолипида кардиолипина, у млекопитающих. Наличие этих изоформ коррелирует с видовой продолжительностью жизни, массой тела и интенсивностью метаболизма. 8. Обнаружено индуцируемое дистамицином возрастание сил взаимодействий в ядре, приближающих энергетическое состояние хроматина, в присутствии физиологически значимых ионов полиаминов, к состоянию морфологически неотличимой компактизации ионами магния. 9. Показано, что замещение остатка γ-глутаминовой кислоты в структуре глутатиона другими аминокислотными остатками изменяет его способность связывать ионы никеля и цинка. Показано, что, помимо самого альфа 1-антитрипсина, в клетках образуется 36-аминокислотный пептид, соответствующий его C-концевому участку. Он влияет на митогенный потенциал клеток в культуре. 10. В основе функциональной гетерогенности макрофагов лежат различия в их транскриптомах. Фактор роста GM-CSF индуцирует образование про-воспалительных макрофагов, а M-CSF – противовоспалительных. Самые сильные про-воспалительные макрофаги индуцируются интерфероном гамма (IFN-γ), а самые сильные противовоспалительные – интерлейкином 4 (IL-4).
8 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Эпигенетические системы
Результаты этапа: 1. Мы осуществили реконструкцию холестерингидроксилазной/лиазной (ХГЛ) ферментативной системы быка в клетках дрожжей S. cerevisiae в форме само-расщепляющегося полипротеина. Исследование активности разных вариантов этой системы показало, что она определяется, главным образом, порядком индивидуальных белковых последовательностей в составе полипротеина. По результатам данной серии исследований опубликована статья в высокорейтинговом журнале “Journal of Biotechnology”. Мы сконструировали рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие экспрессию белков-переносчиков холестерина в бактериальных клетках Escherichia coli. Также получены трансформированные клетки бактерии Methylobacterium mextorquens, экспрессирующие белки системы ХГЛ. Мы показали, что флуоресцентно меченые стероидные субстраты способны проникать в клетки дрожжей S. cerevisiae и Y. lipolytica и участвовать в процессах транспортировки стеролов и метаболизме. 2. Эпигенетические вариации являются важным механизмом адаптации растений к изменчивым условиям внешней среды. В эволюции у растений сформировались сложные механизмы ответов на различные стрессы. Эти механизмы работают в различных масштабах времени – от быстрых физиологических и метаболических ответов, обеспечивающих выживание индивидуальных растений при действии агрессивного фактора, до долговременных эпигенетических модификаций, способствующих адаптации целых популяций растений к устойчиво изменяющимся условиям среды их обитания. Фундаментальные свойства эпигенетических сигналов – важная роль в регуляции экспрессии генов и способность передаваться между поколениями растений – доказывают, что они представляют собой уникальный эволюционно значимый механизм адаптации. По сравнению с классическими мутациями эпигенетические изменения (эпимутации) происходят гораздо чаще и в принципе обратимы. В эволюционных масштабах времени эпигенетически обусловленные адаптивные фенотипы обычно генетически ассимилируются. Однако, в более коротких масштабах времени они явно играют важную роль в адаптации растений к изменяющимся условиям внешней среды. 3. Исследования с помощью гетерохронного парабиоза направлены на решение фундаментальных вопросов системной регуляции старения клеток и органов. Использование «омных» техник в этой области открыло новые возможности, наиболее важной из которых является идентификация системных факторов, способствующих старению и факторов, препятствующих ему. Эффекторы сигнальных путей Wnt и TGF-β и цитокины с прямым действием на активность стволовых клеток, скорее всего, входят в число таких факторов, но многие другие все еще не идентифицированы. Исследования гетерохронного парабиоза, вероятно, помогут и в понимании эпигенетических механизмов регуляции старения. Молекулярные изменения у парабионтных животных сохраняются некоторое время и после окончания эксперимента, что указывает на эпигенетическое репрограммирование клеток под действием измененной системной среды. Однако, в отличие от ситуации с индукцией плюрипотентных стволовых клеток, при парабиозе не изменяется характер дифференцировки клеток, но повышается их регенеративная активность. Эксперименты с гетерохронным парабиозом доказали, что на уровне целого организма возможно не только замедление старения, но даже омоложение, по крайней мере, в отношении некоторых органов. В дальнейшем будет весьма целесообразным исследовать, как изменяется эпигенетический профиль клеток под действием гетерохронного парабиоза. Как система исследования старения на разных уровнях, парадигма гетерохронного парабиоза имеет огромный потенциал в отношении эпигенетики старения и омоложения. 4. После бисульфитного секвенирования характер метилирования ДНК легко дедуцируется путем сравнения ее исходной последовательности с конвертированной. Каждый неметилированный в исходной последовательности остаток С в конвертированной ДНК превращается в остаток T, тогда как метилированные остатки C в конвертированной ДНК остаются остатками C. В исследованиях метилирования ДНК при старении наиболее информативными являются частично метилированные сайты ДНК. После бисульфитной конверсии степень их метилирования определяется путем секвенирования репрезентативной группы субклонов соответствующей области ДНК. Для надежных количественных расчетов таких клонов должно быть не менее 10–20, что делает анализ дорогим и трудоемким. Поэтому мы предпочитаем секвенировать сами продукты ПЦР-амплификации конвертированной бисульфитом ДНК. Выдаваемые при секвенировании по Сэнгеру электроферограммы позволяют рассчитать степень метилирования каждого остатка цитозина по соотношению площадей пиков цитозина и тимина в соответствующей позиции. Поскольку каждый продукт ПЦР-амплификации состоит из большого числа индивидуальных молекул, с точки зрения статистики этот метод является более репрезентативным. чем секвенирование отдельных клонов. Было показано, что точность определения степени метилирования таким методом сравнима с достигаемой при секвенировании 20 индивидуальных субклоновПЦР-фрагмента. Для секвенирования по Сэнгеру мы пользуемся услугами ЦКП «Геном». Пи этом мы используем внутренние ПЦР-праймеры для секвенирования обеих цепей амплифицированной ДНК. Для визуализации и экспорта результатов в файлф формата fasta мы используем бесплатную версию программы Chromas (https://technelysium.com.au/wp/chromas/). Для дедуцирования паттернов метилирования выравнивание конвертированныой и оригинальной последовательности мы осуществляем с помощью веб-сервиса Meth Tools 2.0. 5. Полученные результаты позволяют использовать определенные характеристики ответа растений на солевой стресс как тест-систему для ранней диагностики солеустойчивости. Найденные цитологические критерии позволяют тестировать функциональное состояние клеток у растений уже на стадии развития проростков. Различия между сортами пшеницы в реакциях на солевой стресс, скорее всего, объясняются механизмами нейтрализации и элиминации АФК в стеблях и корнях. Устойчивость к солевому стрессу сопряжена не только с активной экспрессией митохондриальной супероксид-дисмутазы MnSOD, но и экспрессией других супероксид-дисмутаз. 6. Дипептиды глицил-глицин (GlyGly) и глицил-аспарагиновая кислота (GlyAsp), а также аминокислота глицин (Gly) являются биологически активными молекулами, регулирующими рост и развитие растений в концентрациях ~10–7 M. Оба пептида и глицин изменяли экспрессию генов семейств GRF и KNOX в каллусах и проростках табака. Вероятно, именно, изменения в экспресии этих регуляторных генов объясняют влияния исследованных пептидов и глицина на рост и развитие каллусов и проростков. 7. Отрицательно заряженный тетрапептид AEDL, по-видимому, непосредственно взаимодействует с положительно заряженными аминокислотными остатками гистонов, в первую очередь – N-концевым лизиновым остатком гистона H1 и 36-м лизиновым остатком гистона H3. Это приводит к деконденсации хроматина и увеличению активности генов, участвующих в развитии каллусов табака. 8. У женщин в поздней постменапаузе (>60 лет) скорость прогрессирования атеросклероза выше, чем в ранней постменапаузе, что приводит к статистически значимому увеличению толщины интимы сонной артерии за 2 года. У таких женщин фитоэстроген замедляет развитие атеросклероза. 9. Показано, что натуральный противовоспалительный препарат Inflaminat при длительном приеме оказывает положительное действие на течение хронической обструктивной пневмонии: уменьшает выраженность негативных симптомов (одышка, кашель. отделение мокроты) и увеличивает объем форсированного выдоха.
9 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Эпигенетические системы
Результаты этапа: 1. Определены оптимальные условия для синтеза и идентификации гетерологичных стероидогенных белков в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica. Показано, что эффективность синтеза гетерологичных белков в клетках рекомбинантных дрожжей коррелирует с количеством их копий, введенных в клетку. По результатам анализа рекомбинантных штаммов Yarrowia lipolytica подготовлена статья, опубликованная в журнале “Journal of Biotechnology”. 2. Для оптимизации функционирования стероидогенной системы быка в клетках бактерий E. coli использован принципиально новый подход – использование гетерогенных белков-транспортеров гидрофобных соединений для повышения уровня поглощения стероидных субстратов. Показано, что экспрессируемые одновременно со стероидогенными белками транспортные белки StARD1 и StARD3 человека обеспечивают транспорт холестерина через клеточную мембрану, причем StARD3 более эффективно. 3. Совместная экспрессия генов белков-переносчиков холестерина StARD1 и StARD3 человека и белков стероидогенной системы в клетках E. coli увеличивает эффективность функционирования этой системы – продукцию прегненолона – в 1,5 и 2,6 раза, соответственно. StARD3 является более предпочтительным для оптимизации функционирования стероидогенной ХГЛ системы в клетках бактерий. 4. Завершен анализ результатов совместных с группой проф. Шкуматова (НИИ ФХП, БГУ, Минск, Беларусь) исследований взаимодействия флуоресцентных и нефлуоресцентных алкин-меченых стероидных субстратов с клетками бактерий E. coli и дрожжей S. cerevisiae и Y. lipolytica. Результаты оформлены в виде статьи для журнала “Steroids”. 5. Исследованы эффекты коротких биологически активных пептидов AEDG и AEDL на рост каллусов табака Nicotiana tabacum. Оба пептида повышают уровень экспрессии генов, кодирующих ДНК-метилтрансферазы. За счет специфического связывания с CHG-содержащими участками ДНК они могут конкурентно ингибировать метилирование ДНК. 6. Обнаружено, что дипептиды GG и GD и аминокислота глицин модулируют экспрессию генов ДНК-метилтрансфераз и регуляторных белков семейства SNF2 у растений. Глицин и дипептид GG уменьшают экспрессию генов ДНК-метилтрансфераз MET1 и DRM2, но увеличивают экспрессию гена ДНК-метилтрансферазы CMT3. Кислый дипептид GD увеличивает экспрессию генов CMT3 и MET1, но уменьшает экспрессию гена DRM2. Глицин и оба дипептида уменьшают экспрессию большинства генов семейства SNF2. 7. Обнаружено, что ионы магния и полиамины по-разному влияют на структурные переходы хроматина в ядрах клеток печени. Антибиотик дистамицин влияет на стабильность нуклеосом. Эти результаты могут служить основой нового подхода в разработке фармакологических агентов в терапии рака, не имеющих существенной токсичности в отношении здоровых клеток.
10 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Эпигенетические системы
Результаты этапа: 1. Впервые проведены исследования, направленные на изучение функционирования STARD1 и STARD3 человека в живых микроорганизмах и показано, что они способны проявлять in vivo функциональную активность в клетках бактерий, увеличивая внутриклеточное содержание холестерола, что приводит к значительному увеличению уровня его биотрансформации реконструированной ХГЛ системой. На основании сравнительного изучения характеристик STARD1 и STARD3 (уровня синтеза, стабильности, влияния на активность ХГЛ системы) можно заключить, что STARD3 является более предпочтительным кандидатом для оптимизации функционирования стероидогенных систем стероид-трансформирующих ферментов в клетках E. coli. Результаты указывают на то, что предложенный нами подход – использование белка-переносчика для повышения эффективности транспорта стероидов в клетки, является перспективным. Получены новые штаммы липофильных дрожжей Y. lipolytica с реконструированной энзиматической ХГЛ системой быка, компоненты которой синтезируются в клетках в форме «саморасщепляющегося» полипротеина. В том числе штамм Y. lipolytica, несущий дополнительную копию гена АВС1 Y. lipolytica, трансформированный вектором pTEF-АВС1, включающим данный ген, который будет использоваться в дальнейшей работ. 2. С целью выяснения механизмов, объясняющих особенности термического поведения хроматина внутри ядер методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) были определены термодинамические параметры деконденсации внутриядерного хроматина, которая индуцировалась понижением концентрации ионов магния от 5 до 0 мМ. С помощью метода ДСК, позволяющего работать с мутными суспензиями ядер, мы получили термодинамические данные по плавлению внутриядерного хроматина в присутствии ионов магния. Их анализ позволил предположить, что ионы магния в относительно малых концентрациях в условиях ограниченного пространства и высокой плотности внутриядерного хроматина способны вызывать такие изменения в балансе сил взаимодействия между соседними молекулами ДНК и межцепочечными силами внутри ДНК, которые вызывают ее дестабилизацию и снижение Тпл. При этом, стабилизация октамера гистонов в присутствии магния связана с полимерным состоянием ДНК. Повышенные концентрации магния в условия кроудинга в ядре, возможно, приводят к формированию особо стабильных конденсатов нуклеопротеидов, плавящихся с увеличенной энтальпией и Тпл. Полученные результаты позволяют сделать вывод, о том, что магний, понижая Тпл и ослабляя взаимодействие двух цепочек ДНК, способствует действию синтетических ферментов типа полимераз. Известно, что полимеразы создают впереди себя положительное напряжение (торсиональный стресс) в ДНК, препятствующее их движению. Магний, оказывая своё действие на напряжённую ДНК сильнее, чем на релаксированную, тем более способствует продвижению полимеразы. 3. Пептид MKASAA проникает глубоко в клетку через корневую систему и в основном локализуется на ядре в зонах шляпки, меристемы и зоны удлинения. Пептид MKASAA увеличивает экспрессию ДНК-метилтрансфераз, особенно DRM2, которая метилирует ранее неметилированные участки ДНК. В проростках табака, выращенных в присутствии пептида, повышается уровень глобального метилирования ДНК. Увеличение метилирования ДНК происходит по уникальному для растений пути RdDM. Предположительно, пептид связывается с малыми РНК, образуя гигантские частицы, которые ремоделируют хроматин и облегчают метилтрансферазам контакт с ДНК. Повышение уровня метилирования ДНК сопровождается сайленсингом генов семейств GRF, KNOX и EXP. Таким образом, короткий экзогенный пептид MKASAA участвует в глобальных морфологических и генетических изменениях в проростках табака. 4. Пептид AEDL в концентрации оказывает удлиняющее действие на корневые клетки проростков табака, что аналогично действию пептидных фитогормонов. При совместном присутствии AEDL и NaCl развитие корней нормализуется по сравнению с действием только NaCl. Было обнаружено, что локализация и накопление AEDL в корне являются тканеспецифичными. Локализация пептидов может быть эффективно использована для быстрой оценки состояния корневых клеток растений, выращенных в различных условиях, в том числе под воздействием различных факторов. Было выявлено, что действие пептида AEDL приводит к изменению структурной организации хроматина. Увеличение конденсации хроматина в присутствии AEDL приводит к значительным изменениям в экспрессии различных генов, связанных с развитием и дифференцировкой корневой системы. Было обнаружено, что удлинение корней проростков табака в присутствии пептида AEDL и в комбинированном присутствии AEDL и NaCl происходит по разным механизмам. Основываясь на полученных результатах, можно предположить, что пептид AEDL может быть использован для повышения толерантности растений к абиотическим стрессам, включая высокие концентрации хлорида натрия. 5. Результаты исследований свидетельствуют о важной роли взаимодействия метаболитов пробиотических культур: продуктов расщепления белков, углеводов, в частности лактозы, бактериоцинов пептидной природы, антиоксидантов, соединений, функционирующих как нейромедиаторы и нейрогормоны в патологических состояниях, в том числе при раке толстого кишечника. Используемые в качестве пробиотиков благоприятные для здоровья человека микроорганизмы (лактобациллы, бифидобактерии и молочнокислые стрептококки) формируют естественную иммунную защиту, ускоряют процесс регенерации эпителия, а также принимают активное участие в процессах фагоцитоза, показывая высокую эффективность в лечении различных заболеваний желудочно-кишечного тракта. Таким образом, принципиальное значение имеет поддержание баланса между данными микроорганизмами и условно патогенными бактериями.Также возможно использование пробиотиков в профилактике и лечении колоректального рака. 6. Показан ряд положительных эффектов пробиотических микроорганизмов в борьбе с такими заболеваниями кожи как экземы, акне и атопии. Лизаты и гомогенаты, содержащие молочную кислоту и биологически активные вещества, при нанесении на кожу снижают её рН, препятствуют распространению болезнетворных бактерий и приостанавливают воспалительный процесс. Полученные результаты позволяют создавать косметические продукты нового поколения, одним из важных свойств которых является восстановление кожного метаболома, поддержание родной, здоровой кожной микрофлоры и защита от кожных патологий. Молочная кислота и лизаты на основе лактококков являются альтернативой используемых антибиотиков и фунгицидных средств. 7. Оксид азота (NO) поддерживает нормальную структуру стенок кровеносных сосудов. Поддержание гомеостаза NO в организме представляется одной из ключевых задач профилактики и лечении заболеваний, связанных с атеросклерозом, а NO может служить хорошей мишенью для терапевтических и/или профилактических вмешательств у пожилых больных. 8. С возрастом в организме растёт уровень окислительного стресса. Накопление повреждений, приводящее к нарушению целостности генома, может быть причиной развития многих возрастных заболеваний и появления фенотипических и физиологических признаков старения. Система Nrf2 регулируюет экспрессию многочисленных ферментов, ответственных за антиоксидантную защиту и детоксикацию. Способность Nrf2 к активации неуклонно снижается с возрастом. Активация пути Nrf2 является перспективной мишенью для новых фармакологических или генетических терапевтических стратегий. 9. Анализ демографических данных свидетельствует о неравномерном распределении смертности в течение года, месяца и даже в течение недели. Это важно для работы медицинских учреждений, позволяя прогнозировать экономическую и трудовую нагрузку на медучреждения соответствующего профиля. Изучение особенностей колебаний смертности позволяет перейти к изучению ритмов детерминированной смертности. 10. Связанные с поздним отцовством эпигенетические изменения частично наследуются по мужской линии и влияют как на течение беременности, так и на риски возникновения заболеваний, в особенности нейропсихиатрических, у потомков первого поколения. К сожалению, механизмы самих эпигенетических изменений, возникающие с возрастом в мужских половых клетках, изучены недостаточно. Тем не менее, уже сегодня создано несколько моделей эпигенетических часов, позволяющих с высокой точностью определять биологический возраст мужских половых клеток. Наличие таких часов играет огромное значение при разработке подходов к замедлению старения и даже омоложению мужских половых клеток как объективный критерий эффективности предлагаемых методов. 11. Идентификация ключевых транскриптов и выяснение профилей экспрессии генов в антиподальных клетках очень важно для понимания функций антиподальных клеток. Мы обнаружили, что в антиподальных клетках пшеницы активно экспрессируются: ген гидролазы GH17, ген связанного с метаболизмом стероидов белка Oxysterol-binding family protein, ген белка, участвующего в метаболизме ауксинов YUCCA9, ген цитохрома С450 и ген белка теплового шока HSP70.
11 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Эпигенетические системы
Результаты этапа: Показано, что при заражении растений арабидопсиса облигатным паразитическим растением повиликой изменяется экспрессия 742 генов, 541 из которых активируется и 201 – ингибируется в 2 или более раза. При выращивании растений в условиях заражения повиликой на протяжении двух поколений, растения третьего поколения проявляют явные признаки повышенной устойчивости к заражению. Это связано с заблаговременной активацией большой группы (более 100) генов, которые в исходных растениях первого поколения активируются только при заражении повиликой. Кроме того, повышенная устойчивость растений третьего поколения коррелирует с активацией генов, связанных с процессами фотосинтеза и другими зависящими от света реакциями, и генов, кодирующих белки-шапероны, предохраняющие молекулы других белков от повреждений стрессами. Полногеномный анализ паттернов метилирования ДНК показал, что однократное заражение повиликой растений первого поколения и воспитание повышенной устойчивости растений третьего поколения путем повторных заражений в двух предшествующих поколениях сопряжены с обширными изменениями метилирования участков генома, часть которых может иметь отношение к изменениям экспрессии генов и передаваться между поколениями растений. 2. Показано, что использованная ранее система экспорта гетерологичных белков транспорта стероидов STARD1 и STARD3 в периплазму бактерий через Sec-транслокон недостаточно эффективна. Поскольку повышение эффективности этого экспорта критично для достижения высокой эффективности системы биотрансформации стероидов в целом, в текущем году создана другая система экспорта, включающая кДНК STARD1 и STARD3 с N-концевым адресующим пепетидом ТМАО редуктазы (TorA) и экспортную систему через Tat-путь. Полученные плазмиды обеспечивают в клетках E. coli синтез preTorA-STARD1 и preTorA-STARD3. Проводится работа по определению локализации и функциональных характеристик этих белков. Публикаций, индексируемых в базах WoS и Scopus - 7 Из них в Top50 - 5 Публикаций, индексируемых в базе РИНЦ - 2 Публикаций, индексируемых в других базах данных - 7

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен
1. Отчет за 2020 год otchet_MOO_2020.docx 85,2 КБ 18 декабря 2020 [VanyushinBoris]