ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Основными целями исследования являются: Разработка новых лазерно-оптических методов исследования механизмов взаимодействия компонентов крови и сосудов в норме и патологии; исследование механизмов взаимодействия компонентов крови и сосудов в норме и патологии. Результаты исследований, проводимых в рамках проекта, позволят: 1) выяснить, квкие и каким образом компоненты крови участвуют в процессе агрегации клеток; 2) установить синергию компонентов крови как попарно, так и в более сложных комплексах. Это непосредственно связано с возможностью диагностики и мониторинга по компонентам крови социально значимых заболеваний, при которых наблюдается изменение микроциркуляции, а также в последующем и с возможностью направленно управлять агрегацией клеток в норме и патологии.
The study of the nature and mechanisms of the little studied phenomenon of synergism of the influence of various components of blood plasma on the aggregation of red blood cells (AE) in normal and socially significant diseases - diabetes mellitus (DM) and arterial hypertension (AH). Conducting multi-series complex experiments on measuring the parameters of red blood cell aggregation in whole blood samples using optical methods and instruments: a ReoScan laser aggregometer (Korea) (measuring the amplitude of spontaneous aggregation, spontaneous aggregation time, critical shear stress to destroy aggregates) and laser tweezers of our own design and manufacture (measurement of the strength of aggregation and disaggregation in the formation and destruction of paired aggregates, the rate of aggregation, the strength of paired aggregates).
Для достижения поставленных целей будут решены следующие задачи путём измерения параметров агрегации эритроцитов (АЭ) в условиях in vitro: - будут разработаны оригинальные методики и протоколы проведения экспериментов с использованием лазерного агрегометра и лазерного пинцета; - будет изучено влияние разных доступных для экспериментирования компонентов плазмы крови, а именно фибриногена, альбумина и гаммаглобулина, на АЭ по отдельности в зависимости от их концентрации в растворе, в пределах физиологических значений этих компонентов; - будет изучено влияние этих компонентов плазмы крови на АЭ при их нахождении в растворе в различных сочетаниях; изучено изменение параметров АЭ в плазме при искусственном изменении в ней концентрации различных компонентов; изучен характер взаимодействия (адсорбции) фибриногена с мембраной эритроцитов; - будет проведено сравнение различных “сценариев” агрегации и дезагрегации клеток при изменении состава суспендирующих растворов и плазмы. Исследованы особенности АЭ в условиях ингибирования вероятных рецепторов; - будет выполнено исследование вклада ионов кальция в изменение свойств мембраны клеток (ее деформируемости) путем стимулирования и блокирования входа Са2+ в эритроциты; - будет изучено изменение параметров АЭ в крови людей, больных СД и АГ, характеризующихся аномальными значениями концентрации различных компонентов плазмы.
У коллектива имеется более, чем 25-ти летний опыт проведения междисциплинарных исследований на стыке физики, биологии и медицины при тесном сотрудничестве физиков, биологов и медиков. Участники проекта обладают опытом совместной работы по определению реологических параметров крови человека и животных. По данному проекту имеется следующий задел: 1) выполнен цикл работ по численному моделированию взаимодействия лазерного излучения с компонентами крови и моделирующими их частицами; 2) разработаны новые оптические методики, основанные главным образом на диффузном рассеянии и дифракции света, и позволяющие выделять и измерять набор информативных параметров, характеризующих микрореологические свойства эритроцитов в пробах цельной крови и в разбавленных суспензиях; 3) проведены циклы работ c использованием разработанных методов по анализу микрореологических свойств эритроцитов человека и малых лабораторных животных (крыс) в норме и при различных патологиях. Впервые установлено, что у людей, страдающих рядом заболеваний (например, острым нарушением мозгового кровообращения) скорость образования линейных агрегатов эритроцитов значительно выше, чем у здоровых. Прочность агрегатов у больных людей по сравнению со здоровыми, также выше. 4) впервые проведены комплексные исследования по влиянию углеродных наночастиц на микрореологические свойства крови у лабораторных животных и человека. Показано, что в зависимости от размеров и концентрации частиц, а также от свойств их поверхности возможно отрицательное влияние наноалмазов на деформируемость и агрегационные параметры красных клеток крови человека. 5) создана оригинальная компьютерная программа, позволяющая моделировать движение крупной прозрачной диэлектрической частицы в поле оптической ловушки. С ее помощью выполнены расчеты сил и моментов сил, действующих на частицу. Полученные результаты были использованы при создании оптической ловушки, оптимизированной для работы с красными клетками крови.
Разработаны оригинальные методики и протоколы проведения экспериментов с использованием лазерного агрегометра и лазерного пинцета. Изучено влияние разных доступных для экспериментирования компонентов плазмы крови, а именно фибриногена, альбумина и гаммаглобулина, на АЭ по отдельности в зависимости от их концентрации в растворе, в пределах физиологических значений этих компонентов. Изучено влияние этих компонентов плазмы крови на АЭ при их нахождении в растворе в различных сочетаниях. Изучено изменение параметров АЭ в плазме при искусственном изменении в ней концентрации различных компонентов. Изучен характер взаимодействия (адсорбции) фибриногена с мембраной эритроцитов. Проведено сравнение различных “сценариев” агрегации и дезагрегации клеток при изменении состава суспендирующих растворов и плазмы. Исследованы особенности АЭ в условиях ингибирования вероятных рецепторов. Выполнено исследование вклада ионов кальция в изменение свойств мембраны клеток (ее деформируемости) путем стимулирования и блокирования входа Са2+ в эритроциты. Изучено изменение параметров АЭ в крови людей, больных СД и АГ, характеризующихся аномальными значениями концентрации различных компонентов плазмы.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
5 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: Проведена экспериментальная проверка предложенных на предыдущем этапе теоретически методов решения прямой и обратной задачи дифракции лазерных пучков на клетках крови и моделирующих их оптических неоднородностях, случайным образом расположенных на монослоях и в разбавленных суспензиях. Удалось таким образом построить схему регистрации дифракционных картин и подобрать регистрирующие элементы, чтобы минимизировать шумовую компоненту и максимизировать точность определения линий изоинтенсивности с привязкой абсолютного значения их уровней к интенсивности в нуле, существенно расширив при этом динамический диапазон измерений. Проведены измерения на мазках крови человека (здоровых доноров и пациентов, страдающим диабетом и гипертензией), а также на крови малых лабораторных животных (крыс) с экспериментально вызванными теми же заболеваниями. Зарегистрированы существенные различия в параметрах дифракционных картин. По результатам экспериментальной проверки предложенных методов и алгоритмов подана заявка на патент. Проведены комплексные лазерно-оптические исследования механизмов взаимодействия углеродных наночастиц (наноалмазов) разных размеров с белками системы крови человека и крыс (альбумином и гемоглобином). В чпстности исследовано взаимодействие наноалмазных пленок с белковыми пленками, образующимися в результате высыхания растворов. Показана возможность самопроизвольной кристаллизации белка при высыхании раствора на поверхности наноалмазной пленки. Методом КР-спектроскопии установлено, что при взаимодействии с наноалмазной пленкой вторичная структура, структура дисульфидных мостиков и тирозинового дублета белка не меняются по сравнению с этими элементами его структуры в лиофилизованном состоянии, по крайней мере, в объеме белковой пленки толщиной 1 мкм. Тем не менее конформационные изменения могут иметь место в достаточно тонком приповерхностном слое пленки белка (порядка 20 нм). Проводилось комплексное исследование эффектов изменения параметров спонтанной агрегации и сдвиговой дисагрегации, а также деформируемости красных клеток крови при таких социально значимых заболеваниях, как гипертензия и диабет. Измерения проводились в цельной крови человека и крыс, в аутологичной плазме и в модельных растворах белков плазмы крови и других макромолекул с использованием двухканального лазерного пинцета, методов дифрактометрии (эктацитометрии) и диффузного рассеянная света (агрегометрии). Показано наличие существенных изменений микрореологических характеристик, вызванных этими заболеваниями. Изучалась зависимость аыявленных эффектов от тяжести заболеваний, возраста пациентов и наличия сопутствующих заболеваний. | ||
6 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: С помощью лазерных пинцетов проведены серийные измерения силы взаимодействия эритроцитов в плазме крови и в растворах нейтральных макромолекул (широко используемых в клинических исследованиях). Изучена температурная зависимость и показано, что сила взаимодействия эритроцитов при комнатной температуре (25 С) и при близкой к физиологической температуре (38 С) практически не отличаются для процесса спонтанной агрегации, характеризующей скорость образования агрегатов. В то же время для процесса вынужденной дезагрегации эритроцитов, характеризующей прочность агрегата, при понижении температуры наблюдается усиление взаимодействия примерно на 30%. Разработана и опробована методика для нахождения корреляции измерений агрегации эритроцитов на уровне индивидуальных клеток, проводимых с помощью лазерного пинцета, и на ансамбле клеток, проводимых по методу агрегометрии обратного рассеяния света от пробы цельной крови. Сдвиговые напряжения необходимые для остановки спонтанной агрегации эритроцитов, измеренные с помощью лазерных пинцетов на агрегате из двух клеток, количественно совпадают с результатами измерения тех же сдвиговых напряжений на цельной крови с помощью агрегометра. Эти результаты показывают перспективу использования результатов измерений на уровне индивидуальных клеток для изучения взаимодействия клеток в цельной крови и наоборот. По результатам измерений с помощью лазерных пинцетов, оценены энергии взаимодействия эритроцитов и предложены модификации модели, описывающие эти взаимодействия. Впервые получена зависимость энергии взаимодействия эритроцитов от стадии процесса спонтанной агрегации и вынужденной дезагрегации эритроцитов. При этом наблюдалась отличная зависимость, описываемая в первом случае осмотическими силами, во втором случае силами адсорбции макромолекул. Эти результаты позволят существенно продвинуться в понимании биомеханики взаимодействия эритроцитов. Результаты исследования опубликованы в статье: "Probing the red blood cells aggregating force with optical tweezers", Lee K., Danilina A.V., Kinnunen M., Priezzhev A.V., Meglinski I. в журнале IEEE JOURNAL OF SELECTED TOPICS IN QUANTUM ELECTRONICS, с. 7000106; DOI: 10.1109/JSTQE.2015.2477396. Продолжены исследования характера влияния различных наночастиц на компоненты крови и кровеносные сосуды при внутривенном введении наночастиц в кровь лабораторных животных с точки зрения нанотоксикологии и нанобезопасности, а также эффективности их возможного использования в будущем как платформы для клинической биомедицинской визуализации и направленного транспорта лекарств при лечении социально значимых заболеваний человека. В экспериментах, выполненных на КР-микроспектрофлюориметре in vitro, показано, что при адсорбции молекул одного из важнейших белков плазмы крови - альбумина их вторичная структура претерпевает изменения, степень которых зависит от концнентрации наночастиц в растворе и от характера функционализации его поверхности Результаты исследования опубликованы в статье: "Raman microspectroscopy of nanodiamond-induced structural changes in albumin" Svetlakova A.S., Brandt N.N., Priezzhev A.V., Chikishev A.Yu. в журнале JBO, 20(4), с. 047004 (2015), http://dx.doi.org/10.1117/1.JBO.20.4.047004. Также полученные результаты доложены на 5-ом "Сибирском семинаре по спектроскопии комбинационного рассеяния света" - доклад "КР спектроскопия в задаче взаимодействия алмазных наночастиц с альбумином", Брандт Н.Н., Логвина Е.В., Приезжев А.В., Чикишев А.Ю. Тезисы опубликованы в сборнике Пятый "Сибирский семинар по спектроскопии комбинационного рассеяния света", место издания Институт автоматики и электрометрии, Новосибирск, тезисы, с. 47-48. Впервые построена динамическая модель молекулярного мотора «динеина», работающего в стохастическом режиме. Она представляют собой систему двух связанных уравнений типа ФитцХью-Нагумо, работающих в триггерном режиме. Полиномы, описывающие силовые моменты, близки к N-образной форме. Параметры моделей определяются из функциональных схем моторов, построенных на основе экспериментов с применением рентгеноструктурного анализа, криогенной электронной микроскопии, лазерных пинцетов и скоростных методов видеомикроскопии с использованием «квантовых точек» (меток). Другое представление модели дается в виде систем обобщенных уравнений Релея. Были использованы данные экспериментов с применением лазерных пинцентов и светящихся флюоресцирующих меткок (квантовых точек) из работ группы D.Vale ( см. S.L. Reck-Peterson et al. Motile Properties of Cytoplasmic Dynein. // Handbook of Dynein, Pan Stanford Publishing, 2012, 145-171. Модель хорошо соответствует данным этих экспериментов. Результаты работы были доложены на V съезде биофизиков России (2015) в пленарном приглашенном докладе «ДИНАМИКА И ЭНЕРГЕТИКА ВНУТРИНЕЙРОННОГО ТРАНСПОРТА» Романовским Ю.М. Тезисы опубликованы в сборнике V Съезд биофизиков России. Материалы докладов. 4-10 октября 2015 г. Ростов-на-Дону, Изд-во ЮФУ (Ростов н/Д), том 1, с. 43-43. Совместно с сотрудниками ФФМ МГУ исследованы микрогемореологические изменения в крови больных сахарным диабетом первого (СД1) и второго (СД2) типов, а также у пациентов, страдающих акромегалией. С помощью лазерного агрегометра-деформометра (LADE, RheoMedLab, Россия) оценивали способность эритроцитов образовывать агрегаты и кинетику их дезагрегации. Образование крупных агрегатов, их максимальная гидродинамическая прочность и максимальный индекс деформируемости эритроцитов были одинаковым во всех трех группах. Однако при СД2 значимо ниже оказалась внутренняя вязкость эритроцита, а жёсткость мембраны была выше, чем в двух других группах. Эритроциты при СД хуже деформируются, что может влиять на движение крови в микроциркуляторном русле и приводить к микроангиопатиям. Обнаружено, что СД1 характеризуется замедленным образованием и незатруднённым распадом линейных агрегатов, но быстрым образованием трехмерных агрегатов, которые распадаются с трудом. С-пептид приводил к значимому снижению скорости образования монетных столбиков и повышению общей гидродинамической прочности агрегатов. Экспериментально воспроизводили на крысах модели ишемического инсульта и сахарного диабета. Микрогемореологические параметры изучались при экспериментальной фокальной ишемии головного мозга у крыс путём введения аутологичного, заранее приготовленного тромба. При отсутствии существенных изменений деформируемости эритроцитов, наблюдалось изменение скорости образования и прочности их агрегатов. По результатам сделан приглашенный доклад "Optical Assessment of Blood Microrheology in Norm, Disease and at Interaction with Nanoparticles (Invited)", Priezzhev A.V., Lugovtsov A.E., Nikitin S.Yu, Lee K., Ustinov V.D., Fadyukov O.E., Lin M.D., Koshelev V.B., Gurfinkel Yu I., Kinnunen M., Cheng C.L., Perevedentseva E.V., Karmenyan A.V. на конференции: 3rd International conference “BioPhotonics 2015”, Florence, Italy, May 20-22, 2015. Technical Program, p. 5, место издания Florence, Italy, тезисы, с. 5-5 | ||
7 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: Реферат В соответствии с техническим заданием и целью проекта работа велась в направлении разработки новых лазерно-оптических методов исследования живых систем для применения в фундаментальных исследованиях и в практической медицине при диагностике и лечении таких социально значимых заболеваний, как гипертензия, сахарный диабет и сердечно-сосудистая недостаточность. На основе применения разработанных лазерно-оптических методов, появилась возможность измерения различных параметров на молекулярном, клеточном и организменном уровнях, а также построены математические модели строения и функционирования различных биоструктур, проведены численные расчёты и анализ статистической значимости получаемых результатов. Обозначения и сокращения Социально значимые заболевания – заболевания, которыми страдают значительная и постоянно возрастающая часть населения большинства стран мира и являющиеся одной из основных причин смертности населения. Эритроцит - красная клетка крови, ИДЭ – индекс деформируемости эритроцитов, как количественная оценка их способности к изменению формы под действием сдвиговых напряжений в потоке, ГТ – гипертензия, СД - сахарный диабет, ССН - сердечно-сосудистая недостаточность, АЭ - агрегации эритроцитов, ДЭ - дезагрегации эритроцитов, In vitro - вне организма, In vivo - в живом организме. Fa - сила агрегации двух изначально невзаимодействующих клеток с образованием дуплета, Fd - сила дезагрегации, необходимой для разъединения клеток и разрушения дуплета. K = Da/DV – коэффициент ремоделирования капилляра, как отношение диаметров его артериального и венозного отделов. Периваскулярная зона – чётко визуализируемая с помощью капилляроскопа область окружающей терминальный капилляр ткани, с которой идёт преимущественный обмен веществом, переносимым с кровью. Введение Спецификой данной НИР является междисциплинарный подход и комплексное применение методов, основанных на регистрации рассеяния и поглощения света, а также поляризационных, интерференционных и дифракционных явлений в результате взаимодействия лазерного излучения и биологических объектов. Другой особенностью данной НИР является сочетание фундаментального исследования и прикладной направленности разрабатываемых методов для биомедицинских применений. Более конкретно основными объектами исследования были цельная кровь и/или её отдельные компоненты in vitro и кровь, текущая по микрососуду (капилляру) in vivo. Другим классом исследованных объектов были молекулярные моторы, выполняющие различную работу в живых клетках. Основная часть 1. Были разработаны новые лазерно-оптические методы исследования механизмов взаимодействия компонентов крови друг с другом, а также с окружающим их потоком и сосудами в норме и патологии. Разработка велась в трёх приближениях: 1) в высоконцентрированной суспензии взаимодействующих компонентов – клеток и молекул плазмы крови (цельной крови) in vitro, 2) в сильно разбавленной суспензии эритроцитов с различными молекулярными компонентами, растворенными в окружающей клетке среде in vitro, и 3) в капиллярном кровотоке in vivo. 1.1. В первом случае взаимодействия клеток крови описывалось характерными временами спонтанной АЭ и сдвиговой ДЭ, которые измерялись по кинетике изменения интенсивности диффузного рассеяния от образца крови [ 1 ]. Было показано, что: 1) эти параметры отличаются у клеток разного возраста в одном и том же организме; они отличаются в пробах крови, взятых у людей разного возраста; их отклонение от нормы по-разному проявляется для исследованных заболеваний. 1.2. Во втором случае взаимодействия красных клеток крови оценивалось по значениям силы Fa и скорости агрегации (наползания друг на друга) и силы дезагрегации Fd, измеряемым с помощью лазерных пинцетов [ 2,3 ]. Было впервые обнаружено, что Fd > Fa, причём отношение этих величин существенно различно в крови здоровых доноров и пациентов, болеющих СД [ 4 ] . Кроме этого, в сильно разбавленных суспензиях эритроцитов измерялся ИДЭ по результатам обработки дифракционных картин [ 5 ]. На основе решения обратной оптической задачи с использованием нестандартных подходов к регуляризации разработан новый метод и алгоритм, защищённые патентом [ 6 ], позволяющие оценивать не только средние значения этого параметра по популяции, но и первые три момента распределения эритроцитов по деформируемости. 1.3. В третьем случае разрабатывались методы повышения эффективности визуализации кровеносных капилляров ногтевого ложа человека с определением распределения их по поверхности эпонихия, параметров тока крови в различных разделах капилляров, диаметров артериального и венозного отделов капилляров и размера периваскулярной зоны [ 7 ]. Было установлено, в частности, что при развитии СД происходит разрежение капиллярной сети и ремоделирование капилляров, выражающееся в сильном снижении значения К. 2. Были исследованы распределения свойств и значений параметров эритроцитов в норме и патологии. Измерения проводились путём измерения параметров картин дифракции при малоугловом рассеянии лазерного пучка на сухих и влажных мазках крови здоровых доноров и пациентов с ГТ, ССН и СД. Показано, что распределение по размерам клеток крови здоровых и больных людей отличаются [ 8 ]. 3. Были построены новые математические модели молекулярных моторов, работающих в присутствии тепловых шумов. В частности, рассмотрены молекулярные шагающие моторы: кинезин, миозин V и динеин, выполняющие различную работу в живых клетках [ 9 ]. В нейронах они обеспечивают транспорт нейромедиаторов и, таким образом, являются необходимыми компонентами взаимодействия 100 млрд клеток головного мозга. Рассмотрены функциональные схемы этих моторов и построены соответствующие математические модели. Модели представляют собой систему двух связанных уравнений типа ФитцХью—Нагумо. Однако описывающие силовые моменты полиномы высокого порядка близки к N-образной форме. Параметры моделей определяются из функциональных схем моторов, построенных на основе экспериментов с применением рентгеноструктурного анализа, криогенной электронной микроскопии, лазерных пинцетов и скоростных методов видеомикроскопии с использованием "точечных" меток. Сделаны оценки энергетики нейрона. Заключение Междисциплинарный подход и комплексное применение различных физических (главным образом лазерно-оптических) методов, а также методов математической физики и математического моделирования позволил нам существенно продвинуться в отработке новых подходов к измерениям параметров живых клеток, характеризующих наличие и степень тяжести ряда социально значимых заболеваний, а также в объяснении фундаментальных аспектов функционирования живых клеток и их отдельных компонентов. | ||
8 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: | ||
9 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: 1. Исследованы механизмы взаимодействия эритроцитов при их агрегации и дезагрегации в различных средах с помощью разрабатываемых нами оптических методик. Проведен статистический анализ данных, получаемых на образцах крови здоровых доноров и пациентов, страдающих артериальной гипертензией и сердечной-сосудистой недостаточностью. 2. Разработаны новые методы измерения с помощью лазерных пинцетов скорости образования парных агрегатов при взаимодействии одиночных эритроцитов в различных средах. Исследованы явления синергизма влияния различных белков плазмы крови на параметры агрегации эритроцитов 3. Разработаны новые методы измерения распределений эритроцитов по размерам и по способности к изменению своей формы (деформируемости) в сдвиговых потоках. Разработан и построен первый вариант макета портативного эритро-дифрактометра потенциально с более широкими возможностями по сравнению с известными аналогами. | ||
10 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: Разработаны новые методы измерения микрореологических параметров крови в норме и при различных социально-значимых заболеваниях на уровне больших популяций и одиночных клеток in vitro с применением методов диффузного рассеяния, дифрактометрии и лазерных пинцетов. В частности разработаны новые методы измерения с помощью лазерных пинцетов скорости образования парных агрегатов при взаимодействии одиночных эритроцитов в различных средах. Исследованы явления синергизма влияния различных белков плазмы крови на параметры агрегации эритроцитов. Разработаны новые методы измерения распределений эритроцитов по размерам и по способности к изменению своей формы (деформируемости) в сдвиговых потоках. Разработан и построен макет портативного эритро-дифрактометра с более широкими возможностями по сравнению с известными аналогами. С использованием разработанных методов исследованы изменения микрореологических характеристик крови у больных с таким социально-значимым заболеванием, как артериальная гипертензия. | ||
11 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: | ||
12 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: 1. Проведено систематическое исследование влияния наночастиц на метаболическое состояние клеток (модельных клеточных культур и лейкоцитов). Эксперименты проводились с использованием оптического метаболического имиджинга (измерение FLIM, детектирование сигнала НАД(Ф)Н). Получены ответиты на вопрос – при какой минимальной концентрации частиц и при каких их параметрах заметны изменения в оптическом отклике клеток? 2. Ранее нами было выявлено, что сигнал автофлуоресценции от ядер клеток весьма чувствителен к внешним воздействиям. В то же время, интенсивность этого сигнала крайне мала (не более 10 фотонов из одного пикселя при измерениях FLIM при стандартных условиях измерения). Таким образом, неясно, является ли этот сигнал информативным. В нескольких работах время жизни автофлуоресценции из области ядра используется в качестве индикатора состояния клеток, однако, природа этого сигнала дискуссионна. Для определения природы сигнала автофлуоресценции нами исследованы изображения клеток (фибробластов– относительно крупных клеток (10-15 мкм)), полученные методом FLIM с двухфотонным возбуждением в диапазоне 690-850 нм. Целью данного исследования было получение спектральных зависимостей интенсивности и среднего времени жизни флуоресценции для областей внутри цитоплазмы клеток, внутри ядра и фона. 3. Была продолжена работа по исследованию фотофизических свойств в мультимодальных контрастных агентах для оптической томографии (самотушение красителя, перенос энергии электронного возбуждения, усиление флуоресценции и т.д.) с целью оптимизации их свойств. 4. Были продолжены начатые ранее исследования по измерению in vitro влияния различных наночастиц на реологические свойства крови, на параметры взаимодействия одиночных клеток крови и на способность эритроцитов деформироваться с целью набора статистических данных. a) Проведение серии экспериментов методом диффузного рассеяния света: измерения гидродинамической прочности и характерного времени образования агрегатов. б) Проведение серии экспериментов методом лазерной дифрактометрии: измерение индекса деформируемости эритроцитов. в) Проведение серии экспериментов на оптическом пинцете: измерение сил агрегации и дезагрегации, скорости образования парных агрегатов 5. Были проведены серии экспериментов по in vitro влиянию магнитных наноалмазов на микрореологические свойства эритроцитов и агрегацию тромбоцитов методами диффузного рассеяния света, лазерной дифрактометрии и оптического захвата. 6. Было продолжено изучение механизмов взаимодействия НЧ с клетками крови (адсорбция на мембране клеток и / или проникновение внутрь) методами флуоресцентной микроскопии и спектроскопии. 7. Были проведены исследования по изучению влияния НЧ на микрореологические параметры крови в норме и при социально-значимых заболеваниях (артериальная гипертензия, сердечно-сосудистые заболевания и т.п.) в разработанных нами каналах с эндотелиальными клетками и без них. | ||
13 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: Были получены новые данные о влиянии различных наночастиц на агрегационные и деформационные свойства эритроцитов, и агрегационные свойства тромбоцитов. Рассмотрено большее количество концентраций с целью уточнения эффекта. Получены новые дополненные зависимости, позволяющие сделать обстоятельные выводы. Были продолжены эксперименты с различными наночастицами (наноалмазы с поверхностной функционализацией карбоксильными группами для увеличения биосовместимости), магнитные наноалмазы, диоксид титана TiO2, оксид алюминия Al2O3, оксида цинка ZnO со средними характеристическими размерами от 100 до 300 нм). Влияние наночастиц на микрореологические параметры крови изучалось с помощью лазерно-оптических методов in-vitro, таких как лазерная дифрактометрия, лазерная агрегометрия эритроцитов (лазерный агрегометр RheoScan AnD-300, Корея), оптического захвата (собранный в лаборатории лазерный пинцет) и лазерной агрегометрии тромбоцитов (лазерный агрегометр Biola LA-230-2, Россия). Показано, что наибольший эффект в увеличении характерного времени агрегации наблюдается в образцах, инкубированных с наноалмазами и наночастицами TiO2. Тенденция роста сил агрегации и дезагрегации в обоих случаях одинакова, но абсолютные значения силы дезагрегации выше, чем значения силы агрегации. Продемонстрирована высокая чувствительность метода диффузного светорассеяния к изменениям микрореологических параметров крови после инкубации образцов цельной крови с различными наночастицами – в этих параметрах были обнаружены статистически значимые различия. Показано, что на уровне отдельных клеток наночастицы усиливают агрегацию (образование дуплетов и небольших линейных агрегатов) и, в то же время, препятствуют образованию больших агрегатов. Таким образом на начальном этапе агрегации наночастицы выступают в качестве индуктора агрегации, и на последующих этапах – в качестве ингибитора агрегации эритроцитов. По результатам исследования деформируемости эритроцитов сделан вывод о том, что предел текучести мембран клеток существенно изменяется при разных концентрациях магнитных наноалмазов, тогда как вязкость внутриклеточного содержимого остается постоянной. Это означает, что наночастицы не проникают внутрь мембраны эритроцита, но влияют на её мембрану, делая её менее жесткой. При этом максимальный эффект наблюдается при концентрации 200 мкг/мл. При 400 мкг/мл предел текучести не отличим от контроля. Также было исследовано влияние магнитных алмазных наночастиц на агрегацию тромбоцитов у здоровых людей и пациентов, страдающих различными заболеваниями. Сделан вывод о том, что отличия в характере заболеваний, например, артериальная гипертензия без сопутствующих заболеваний и без оных, могут играть роль в кинетике образования тромбоцитарных агрегатов. В целом было показано, что • Наночастицы для крови здоровых доноров являются ингибиторами агрегации эритроцитов. При повышении концентрации эффект становится сильнее. • Гидродинамическая прочность агрегатов в зависимости от концентрации наночастиц разных типов изменяется нелинейно. При определенных типах наночастиц и определенных концентрациях можно видеть как увеличение гидродинамической прочности, так и уменьшение. • Наночастицы в первом приближении не изменяют деформируемость эритроцитов существенно. Значимое воздействие обусловлено влиянием наночастиц на мембрану эритроцитов: предел текучести существенно изменяется (уменьшается) при разных концентрациях магнитных наноалмазов, тогда как вязкость внутриклеточного содержимого остается постоянной. Это значит, что наночастицы влияют только на мембрану эритроцита, и делают её менее жесткой при концентрации магнитных наноалмазов менее или равно 200 мкг/мл. • Наночастицы оксида титана являются ингибиторами агрегации тромбоцитов, когда как магнитные наноалмазы – индукторами. | ||
14 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: За 2023 год выполнения проекта были разработаны и апробированы дизайны экспериментов и протоколов мультимодального применения комплекса оптических и лазерных методов как просветления тканей, так и измерения микрореологических характеристик клеток крови и параметров микроциркуляции крови человека и лабораторных животных в режимах как in vitro, так и in vivo. Были получены результаты, которые расширяют знания по влиянию различных оптических просветляющих агентов (ОПА) как с точки зрения просветления тканей, так и с точки зрения их влияния на микрореологию крови. В качестве осмотически активных ОПА использовались следующие: раствор глицерина, раствор глицерин-пропиленгликоль (ПГ), раствор фруктозы, Омнипак-300, раствор Омнипак-300-ПГ, Визипак-270, а также кедровое масло. С помощью оптически когерентной томографии (ОКТ) были проведены эксперименты по влиянию различных ОПА на просветление кожи человека in vivo. Измерения проводились в течение 15 минут после нанесения ОПА. В измерениях участвовало 6 добровольцев, возраст которых составлял 19–25 года. Было получено, что все используемые ОПА просветляют кожу, причем степень просветления отличается. Проведены эксперименты по влиянию глицерина, как ОПА, на агрегацию и активации тромбоцитов. Было получено, что добавление глицерина в плазму крови уменьшает агрегацию тромбоцитов, причем степень уменьшения зависит от концентрации глицерина. Также было оценено влияние глицерина и Омнипака-300 в качестве ОПА на агрегационные и деформационные свойства эритроцитов in vitro. Было получено, что наличие глицерина в растворе не влияет на прочность эритроцитарных агрегатов, однако при увеличении концентрации глицерина агрегация и деформируемость эритроцитов уменьшается. Для Омнипака-300 наблюдалось падение агрегации эритроцитов, и вместе с тем наблюдалось увеличение деформируемости эритроцитов при концентрации 5%. Дальнейшие работы по этому направлению будут вестись с целью оптимизации существующих методик подготовки образцов и набора статистики результатов с целью получить данные, отчетливо характеризующие влияние Омнипака-300 и глицерина на микрореологические параметры крови. Было исследовано влияние разных ОПА на скорость капиллярного кровотока на пальцах здоровых доноров. Получено, что скорость капиллярного кровотока зависит от типа ОПА, причем статистически значимые различия наблюдаются между олеиновой кислотой и остальными ОПА. Причинами такого изменения могут быть действие ОПА на микрососуды и свойства эритроцитов. При решении задач проекта были проанализированы гемореологические параметры здоровых доноров и пациентов с разными заболеваниями. Анализ данных показал взаимозависимость ряда параметров для пациентов разного пола, а также с определенными сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ), в частости, людей с хронической сердечной недостаточностью, ишемической болезнью сердца, артериальной гипертензией (АГ) и др. Было показано, что сопутствующие заболевания с АГ приводят к усилению агрегации эритроцитов (АЭ), причем наблюдается статистически значимая разница между группами пациентов с разными сопутствующими заболеваниями (к примеру, при сравнении пациентов с АГ и пациентов с АГ и фибрилляцией предсердия (ФП)). Также были проанализированы гемореологические параметры здоровых лиц, лиц без ССЗ, но перенесших заболевание КОВИД-19, а также больных ССЗ без и в сочетании с перенесенным КОВИД-19. По сравнению с комплексом гемореологических характеристик здоровых лиц во всех трех группах была достоверно высокая вязкость крови, как при высоких, так и низких скоростях сдвига. Она сочеталась с повышенной вязкостью плазмы, суспензии эритроцитов и их агрегации, при сниженной деформируемости клеток и более низким транспортным потенциалом крови. Однако не выявлено статистически значимой разницы вязкостных характеристик крови и деформируемости эритроцитов у больных ССЗ без КОВИД-19 и с этим перенесенным заболеванием. Исключение составляет только АЭ: она на 40% была больше у больных ССЗ+КОВИД-19, а также при сравнении двух групп здоровых лиц (без ССЗ), но с КОВИД-19 (группа 2) и без него, было найдена повышенная агрегация эритроцитов у лиц группы 2 (на 40%; р<0,05). Во всех группах наблюдения донор NO умеренно повышал деформируемость эритроцитов (ДЭ) и выражено снижал АЭ. Такой же эффект обнаружен и при инкубации интактных эритроцитов, их теней, фракций клеток, разделенных по возрасту с L-аргинином – стимулятором NO-синтазы в клетках. Был исследован сигнальный путь, ассоциированный с микрореологическими ответами эритроцитов на NO. С помощью разных методов было установлено, что эффекты действия нитропруссид натрия (НПН) и L-аргинина полностью устраняются при ингибировании растворимой гуанилатциклазы и/или NOS как в эритроцитах, так и в эндотелии. У здоровых лиц и больных ССЗ, перенесших КОВИД-19 негативно изменены параметры гемокоагуляции и агрегация тромбоцитов. Выявлены значительные корреляции между этими характеристиками. Методом лазерно доплеровской флоуметрии (ЛДФ) с применение функциональных проб (окклюзионной пробы и ионофоретические пробы с ацетилхолином и нитропруссидом натрия) были выявлены нарушения микрососудистой перфузии и функции эндотелия. Также в рамках данного проекта были проведены эксперименты по изучению взаимодействия сосудистого эндотелия (HUVEC) и эритроцитов, а также влияния эндотелия на агрегационные свойства эритроцитов как при разных концентрациях фибриногена, так и при разных концентрациях донора оксида азота. Было получено, что взаимодействие одиночных эритроцитов и монослоя эндотелия происходит с силами порядка 1 пН, что примерно в 6 раз меньше сил взаимодействия эритроцитов между собой. Данное взаимодействие зависит от концентрации фибриногена, причём силы взаимодействия выходят на насыщение при его концентрации больше 4 мг/мл. Также была разработана проточная камера, дно которой покрыто эндотелием, и проведена отработка методики измерения. Были предложены новые параметры, которые характеризуют взаимодействие эритроцитов и монослоя эндотелия. Исследование, выполненное на данном этапе, показывает, как изменяются и коррелируют параметры микроциркуляции у пациентов как с ССЗ, так и пациентов с перенесённой коронавирусной инфекцией. Также были изучены частные вопросы взаимодействия клеток крови как между собой, так и с сосудистым эндотелием. Были проведены предварительные эксперименты по изучению возможностей коррекции изменяемых в результате заболеваний параметров крови. Так, было показано, что макромолекулы белка фибриногена адсорбируются на мембране эритроцитов благодаря интегрин-гликопротеиновым комплексам IIb/IIIa, расположенным на её поверхности. Экспериментально подтверждена гипотеза о том, что агрегация эритроцитов при ССЗ может быть скорректирована за счет уменьшения адсорбции фибриногена на мембране эритроцитов посредством ингибирования гликопротеиновых комплексов IIb/IIIa с использованием препаратов тирофибана, РГДС, эптифибатида. Данное ингибирование уменьшают связывание молекул фибриногена с клеточными мембранами, что приводит к уменьшению молекулярных мостиков между взаимодействующими клетками. В 2023 году было подготовлено и опубликовано 12 статей, сделано 36 докладов на международных конференциях. | ||
15 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: | ||
16 | 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. | Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".